Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Cancer Research
0 visualizações • 3:06 min. • April 30th, 2023
As células mononucleares do sangue periférico ou PBMCs incluem células B, células T, células natural killer ou NK e monócitos. As células B produzem moléculas de imunoglobulina para combater infecções. Na leucemia, essas células se multiplicam e metastatizam para diferentes órgãos.
Para isolar as células B, comece com uma suspensão de PBMCs isoladas. Adicione uma mistura de anticorpos primários direcionada contra moléculas específicas da superfície celular chamada cluster de diferenciação ou CD. Anticorpos específicos se ligam à molécula de CD-3 nas células T, à molécula de CD-14 nos monócitos e à molécula de CD-16 nas células NK, deixando as células B sem marcação.
Em seguida, lave a amostra para remover os anticorpos não ligados. Adicione microesferas magnéticas conjugadas com anticorpos secundários à amostra. Os anticorpos secundários se ligam à região FC dos anticorpos primários ligados a células específicas. Coloque o tubo contendo a suspensão celular marcada sob a influência de um campo magnético. No campo, as células marcadas magneticamente migram e se ligam à parede do tubo, levando à seleção negativa das células indesejadas. Recolher o sobrenadante contendo células B enriquecidas para um novo tubo de recolha.
Neste protocolo, realizaremos uma seleção imunomagnética negativa de células B leucêmicas de PBMCs de pacientes com leucemia linfocítica crônica.
Descarte o sobrenadante e ressuspenda 10 milhões de PBMCs em um mililitro de tampão de isolamento, que é PBS com 0,1% de BSA e 2 milimolares de EDTA, com o pH ajustado para 7,4. Os linfócitos da LLC agora precisam ser purificados das preparações de PBMC. Em seguida, adicione 10 microgramas de anticorpos primários monoclonais anti-CD-3, CD-14 e CD-16 de camundongo e incube por 30 minutos a 4 graus Celsius.
Depois de lavar as células com o tampão de isolamento e centrifugar a 500 vezes g por 5 minutos a 4 graus Celsius, ressuspender os 10 milhões de PBMCs em 1 mililitro de tampão de isolamento. Incube as células ressuspensas com 100 microlitros de esferas magnéticas lavadas por 30 minutos a 4 graus Celsius com ressuspensão suave. Em seguida, coloque o tubo no suporte magnético por dois minutos e transfira o sobrenadante com as células não ligadas para um novo tubo com uma pipeta de 5 mililitros. Após esta etapa, os linfócitos purificados da LLC estão prontos para serem usados.