Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiology
0 visualizações • 2:28 min. • September 26th, 2025
Comece com uma cultura de E. coli isolada de recém-nascidos com infecções da corrente sanguínea.
Centrifugue para pellet a bactéria, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um meio livre de antibióticos.
Pegue uma placa com um inserto transwell contendo uma monocamada de células epiteliais intestinais.
Meça a resistência elétrica em toda a camada celular com uma sonda para confirmar a integridade da monocamada.
Adicione a suspensão bacteriana na inserção e incube.
As bactérias aderem às células epiteliais, são internalizadas dentro das vesículas e são transportadas através das células para o poço inferior por meio de um processo chamado transcitose.
Meça novamente a resistência elétrica; Um valor estável confirma uma monocamada intacta durante a transcitose.
Transfira o inserto para um novo poço e colete o meio do poço inferior anterior.
Coloque o meio coletado em uma placa de ágar e incube para desenvolver as colônias bacterianas.
Conte as colônias para determinar a extensão da transcitose de E. coli através da barreira epitelial intestinal.
A cada 30 minutos após a inoculação, encha novos poços com 500 microlitros de TCM sem antibióticos e transfira as inserções para esses novos poços. Colete a mídia do poço coletor usado para cada inserção em um tubo rotulado separado e coloque o tubo no gelo. Retorne a placa Transwell para a incubadora entre os pontos de tempo.
Para cada inserção, combine a mídia coletada de diferentes pontos de tempo e vortex brevemente. Plaquear o meio recolhido em placas helicoidais LB utilizando o método de diluição em pista para quantificar o número de bactérias transcitadas nas primeiras duas horas do ensaio. Colete a mídia em quatro e seis horas.
Além disso, às seis horas, coloque a mídia dos poços de controle. Às seis horas, medir e registar o TEER. Após a incubação durante a noite, contar manualmente as colónias bacterianas nas placas LB de diluição da pista.