Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiology
0 visualizações • 3:13 min. • September 26th, 2025
Faça uma cultura de S. aureus sensível ao antibiótico cloranfenicol.
Centrifugue para pellet a bactéria e remova o sobrenadante.
Transfira o pellet para um tubo contendo meios limitadores de nutrientes e incuba. O estresse nutricional aumenta a competência - a capacidade da bactéria de internalizar DNA estranho.
Centrifugue novamente e remova o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em meio fresco limitante de nutrientes.
Em seguida, adicione DNA extraído de uma cepa de S. aureus carregando um gene resistente ao cloranfenicol. Incubar.
A maquinaria de captação de DNA processa o DNA em uma única fita e o transloca para o citoplasma, onde se integra ao cromossomo bacteriano.
Centrifugue e remova o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em meios ricos em nutrientes.
Transferir a suspensão para um ágar fundido rico em nutrientes contendo cloranfenicol.
Despeje a mistura em um prato e incuba.
O crescimento de colônias resistentes ao cloranfenicol indica absorção bem-sucedida de DNA.
Cultive a célula receptora durante a noite, em cinco mililitros de TSB a 37 graus Celsius com agitação. Na manhã seguinte, transfira 0,5 mililitros da cultura noturna para um tubo de 1,5 mililitro.
Precipitar as células por centrifugação. Em seguida, suspenda as células com 10 mililitros de meio CS2 em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, crescem as bactérias a 37 graus Celsius com agitação a 180 rotações por minuto durante oito horas até a fase exponencial tardia.
Colha as células por centrifugação. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mililitros de meio CS2 fresco. Adicionar 10 microgramas de plasmídeo purificado ou de ADN genómico à suspensão celular.
Agite a cultura a 180 rotações por minuto. Em seguida, colete as células por centrifugação. Ressuspenda as células em 10 mililitros de meio BHI.
Misture a suspensão celular com 90 mililitros de suplemento de ágar BHI derretido com 32 miligramas por litro de cloranfenicol, E cinco microgramas por litro de tetraciclina no experimento de controle. Despeje a mistura nas placas de Petri de 90 milímetros, esfrie rapidamente e deixe o ágar solidificar. Replique as colônias usando palitos de dente em placas contendo antibióticos apropriados para confirmar suas características de resistência.