Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiology
0 visualizações • 2:30 min. • September 26th, 2025
Comece com células de E. coli do doador carregando um plasmídeo F no qual um gene de transferência é substituído por um gene de resistência a antibióticos.
Essas células também contêm um plasmídeo de resgate que codifica o gene de transferência ausente.
Pegue volumes iguais de células receptoras de E. coli com um gene de resistência a antibióticos diferente em seu DNA.
Misture as duas culturas em meios nutritivos sem antibióticos e incube sem agitar.
O plasmídeo de resgate da bactéria doadora expressa o gene de transferência, permitindo que a célula doadora construa um F-pilus.
O pilus forma uma ponte entre duas células, permitindo a transferência unidirecional do plasmídeo do doador para o receptor, formando transconjugantes.
Vortex a mistura para interromper os pares de acasalamento e coloque-a no gelo para evitar mais acasalamento.
Localize a cultura em placas de ágar contendo antibióticos selecionáveis transconjugantes e incuba.
Os transconjugantes, portadores de ambos os genes de resistência a antibióticos, sobrevivem e formam colônias na presença de ambos os antibióticos, confirmando a transferência bem-sucedida do plasmídeo F.
Em duplicata, alíquota de 100 microlitros de células doadoras e 100 microlitros de células receptoras para 800 microlitros de meio LB estéril para um mililitro de volume total. Deixe as células acasalarem a 37 graus Celsius por uma hora sem tremer. Depois de uma hora, vórtice as células por 30 segundos para interromper os pares de acasalamento.
Em seguida, coloque as células no gelo por 10 minutos para evitar mais acasalamento.
Selecione as células MC4100 transconjugantes que abrigam o nocaute de cloranfenicol pOX38-Tc, identificando alíquotas de dez microlitros de cada diluição em cada metade das placas de ágar contendo estreptomicina e cloranfenicol. Repita para ambas as misturas duplicadas. Em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius.