Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiology
0 visualizações • 3:19 min. • September 26th, 2025
Comece inoculando uma bactéria patogênica em um tubo contendo um meio líquido.
Incube para promover a proliferação bacteriana e, em seguida, transfira a cultura para tubos frescos.
Gire as células em pellets e descarte o sobrenadante.
Ressuspenda os pellets bacterianos em soluções tampão contendo concentrações crescentes de mononucleotídeo de flavina (FMN), um fotossensibilizador e uma solução tampão sem FMN para servir como controle.
Misture bem o conteúdo do tubo e transfira as suspensões para tubos de vidro.
Exponha os tubos à luz visível para fotoativar o FMN, que reage com o oxigênio molecular para gerar espécies reativas de oxigênio (ROS).
As ROS danificam os componentes celulares bacterianos, reduzindo assim a viabilidade bacteriana.
Transfira as alíquotas da amostra para meios sólidos, espalhe-as uniformemente e incube para permitir que as bactérias viáveis sobreviventes se transformem em colônias.
Após a incubação, quantificar as colônias e calcular a porcentagem de redução na viabilidade bacteriana em comparação com o controle para avaliar o efeito dose-dependente do FMN.
Inocule uma colônia de Staphylococcus aureus em 10 mililitros de caldo de lisogenia em um tubo de ensaio com tampa de rosca de 15 mililitros. Cultive a cultura a 37 graus Celsius por 16 horas em uma coqueteleira. Transfira 0,5 mililitros da cultura para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.
Dilua a cultura para uma densidade óptica de 0,5 a 600 nanômetros adicionando água esterilizada. Em seguida, transfira 0,5 mililitros da cultura para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugar a 14.000 g durante 10 minutos e decantar o sobrenadante.
Adicione um mililitro de solução tamponada FMN ao pellet celular e ao vórtice. Para controle irradiado, adicione um mililitro de tampão fosfato. Transfira um mililitro de solução de células bacterianas contendo FMN 30 micromolar e tampão fosfato para tubos de vidro.
Coloque-os para uma radiação sob luz violeta a 10 watts por metro quadrado por 30 minutos. Em seguida, transfira um mililitro de solução de células bacterianas contendo 30, 60 e 120 micromolares FMN e tampão fosfato em tubos de vidro. Irradie com luz azul por 120 minutos a 20 watts por metro quadrado.
Além disso, irradie um tubo contendo um mililitro de FMN 120 micromolar por 60 minutos. Após a irradiação, adicionar 0,2 mililitros da solução de reação a uma placa de ágar luria. Espalhe a solução usando uma haste de vidro em forma de L e incube durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, calcule a contagem de placas viáveis e a taxa de inativação de Staphylococcus aureus.