Quantificação da inativação bacteriana induzida por luz através da geração de espécies reativas de oxigênio

Comece com uma mistura de reação tamponada contendo L-metionina, um doador de elétrons, nitro azul de tetrazólio ou NBT, um indicador redox, e mononucleotídeo de flavina ou FMN, um fotossensibilizador.

Adicione esta mistura a um tubo contendo o pellet bacteriano e o vórtice.

Transfira a solução para um tubo de vidro.

Agora, irradie a mistura com luz violeta para ativar o FMN, que aceita um elétron da L-metionina, formando um intermediário reativo.

Esse intermediário transfere o elétron para o oxigênio molecular dissolvido, gerando espécies reativas de oxigênio ou ROS próximas à superfície bacteriana.

As EROs resultantes danificam os componentes celulares e reduzem a viabilidade bacteriana.

O ROS também reduz o NBT a formazan, um produto de cor azul que se deposita perto da superfície bacteriana.

Transfira a mistura para um tubo, centrifugue-o e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet em um solvente orgânico para solubilizar o formazan.

Finalmente, meça a absorbância para determinar a inativação bacteriana induzida pela luz através da geração de ROS.

Preparar as amostras de Staphylococcus aureus como descrito anteriormente para obter um sedimento de células. A 75 mililitros de tampão fosfato, adicione 0,1093 gramas de L-metionina, 0,1 grama de NBT e 25 mililitros de solução FMN.

Adicione um mililitro de cada solução reagente com concentrações variadas de FMN aos pellets celulares e ao vórtice. Irradie as soluções sob luz violeta a 10 watts por metro quadrado por 10 minutos. Centrifugar a mistura a 14.000 g durante 10 minutos e transvasar o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet em um mililitro de dimetilsulfóxido para extrair o NBT reduzido. Registre a absorbância em 560 nanômetros.