Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiology
0 visualizações • 4:16 min. • October 30th, 2025
Tome um lisado bacteriano contendo proteínas hidrofílicas, lipoproteínas e agregados de proteínas.
Adicione um detergente frio e não iônico capaz de separação de fases em temperaturas mais quentes.
Incube no gelo e misture periodicamente. O detergente se liga à porção lipídica da lipoproteína, formando complexos proteína-detergente.
Aqueça a mistura para induzir a separação de fases. As lipoproteínas concentram-se na fase detergente, enquanto as proteínas hidrofílicas permanecem na fase aquosa.
Centrifugue à temperatura ambiente para manter a separação bifásica.
Descarte a fase aquosa, adicione um tampão frio à fase detergente e misture.
Repita o ciclo de resfriamento, aquecimento e centrifugação para enriquecer as lipoproteínas.
Em seguida, adicione tampão frio e centrifugue a baixa temperatura para granular os agregados não lipoproteicos.
Transferir o sobrenadante para um tubo contendo um solvente precipitante de proteínas e incubar a temperatura inferior a zero para precipitar as lipoproteínas.
Centrifugue à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
As lipoproteínas precipitadas estão prontas para estudos a jusante.
Suplementar o sobrenadante com surfactante TX-114 até uma concentração final de 2%, adicionando um volume igual de surfactante a 4% em TBSE gelado. Incubar o sobrenadante suplementado no gelo durante uma hora, misturando por inversão de 15 em 15 minutos. Transfira o tubo para um banho-maria de 37 graus Celsius e incube por 10 minutos para induzir a separação de fases.
Centrifugue a amostra a 10.000 vezes g por 10 minutos em temperatura ambiente para manter a separação bifásica. Pipetar suavemente a fase aquosa superior e eliminar. Adicione TBSE gelado à fase surfactante inferior para reabastecer o tubo ao seu volume original e inverter para misturar.
Incube no gelo por 10 minutos. Após a incubação, transfira o tubo para um banho-maria a 37 graus Celsius e incube por 10 minutos para induzir a separação de fases, depois centrifugue a 10.000 vezes g por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois de repetir essas etapas mais uma vez para um total de três separações, remova a fase aquosa superior e descarte.
Remover o sedimento de proteínas precipitadas que se formaram durante o curso das extracções, adicionando um volume de TBSE gelado à fase de surfactante. Centrifugue a quatro graus Celsius e 16.000 vezes g por dois minutos para granular a proteína insolúvel. Transfira imediatamente o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 2,0 mililitros contendo 1.250 microlitros de acetona 100%.
Misture a amostra por inversão e incube durante a noite a menos 20 graus Celsius para precipitar a proteína. No dia seguinte, centrifugue a amostra a 16.000 vezes g por 20 minutos em temperatura ambiente para pellet as lipoproteínas com atenção à orientação do tubo. Lave o pellet duas vezes com acetona 100% antes de decantar a acetona e deixar a amostra secar ao ar.
Em seguida, adicione 20 a 40 microlitros de Tris-HCL 10 milimolares, pH 8,0, e ressuspenda completamente o pellet pipetando para cima e para baixo contra a parede com as lipoproteínas precipitadas.