Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiology
0 visualizações • 3:28 min. • October 30th, 2025
Comece com uma solução de resina de troca iônica contendo grupos funcionais carregados positivamente para ligação seletiva a proteínas.
Em seguida, pegue um extrato de proteína obtido de células bacterianas hospedeiras projetadas para superexpressar um fator de virulência da bactéria patogênica Helicobacter pylori.
O extrato contém o fator de virulência alvo junto com proteínas da célula hospedeira em um tampão em pH 8.
Misture o extrato de proteína com a resina e incube com agitação para garantir uma interação proteína-resina uniforme.
As proteínas do hospedeiro, com pontos isoelétricos inferiores ao pH do tampão, tornam-se carregadas negativamente e se ligam à resina carregada positivamente.
A proteína alvo, com um ponto isoelétrico próximo ao pH do tampão, permanece em grande parte sem carga e permanece sem ligação.
Transfira a pasta proteína-resina para uma coluna de cromatografia e deixe a resina assentar.
Recolha a fase líquida que contém a proteína-alvo não ligada.
Enxágue a resina com o tampão para garantir a recuperação máxima da proteína alvo.
Para preparar 15 mililitros de resina DEAE, suspenda 0,6 gramas de pó seco de resina DEAE em 30 mililitros de tampão Tris-HCl em temperatura ambiente por pelo menos um dia.
Centrifugue a resina a 10.000 vezes g a quatro graus Celsius por um minuto e, em seguida, remova e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione 15 mililitros de tampão Tris-HCl. Depois de repetir a centrifugação, etapas de ressuspensão mais quatro vezes, armazene os 15 mililitros de resina sedimentada a quatro graus Celsius para uso posterior.
Trabalhando a quatro graus Celsius, adicione 45 mililitros das proteínas solúveis preparadas a 15 mililitros da resina e transfira para um copo de 100 mililitros com barra de agitação. Agite a pasta de resina de proteína usando uma placa de agitação a quatro graus Celsius por uma hora. Em seguida, despeje a pasta de resina de proteína em uma coluna de plástico ou vidro equipada com uma torneira e deixe a resina assentar sob a gravidade.
Abra a torneira para permitir que a solução de proteína escorra através da coluna por fluxo de gravidade até que o nível de líquido na coluna esteja um pouco acima da resina. Coletar o fluxo como a fração não ligada que contém a proteína purificada de ativação de neutrófilos. Adicione 15 mililitros do tampão Tris-HCl gelado na coluna.
Abra a torneira novamente para permitir que o tampão de lavagem passe pela coluna por fluxo de gravidade até que o nível do líquido na coluna esteja logo acima da resina. Colete o fluxo como a fração de lavagem. Repita a lavagem com tampão gelado mais quatro vezes para coletar as frações de lavagem adicionais.