Cultura de Haemophilus influenzae não tipável

Comece com uma cepa de Haemophilus influenzae não tipificável, um patógeno do trato respiratório humano.

Listre a cultura bacteriana em meios seletivos ricos em nutrientes e incuba-a em condições enriquecidas com CO₂ para imitar o ambiente do trato respiratório.

Durante a incubação, as bactérias utilizam nutrientes e se multiplicam, formando colônias.

Transfira uma colônia para meio líquido seletivo e incube para promover o crescimento bacteriano em cultura líquida.

Transferir uma alíquota para um tubo de microcentrífuga.

Centrifugue para separar as bactérias e descartar o sobrenadante.

Ressuspender as bactérias num tampão, centrifugar novamente para lavar e separar as bactérias e rejeitar o sobrenadante contendo o meio residual.

Ressuspenda as bactérias no tampão e dilua.

Usando um espectrofotômetro, medir a densidade óptica a 600 nm para estimar a concentração bacteriana.

Coloque a cultura bacteriana diluída em meio seletivo e incube para formar colônias.

Contar as colónias para calcular as unidades de formação de colónias para preparar o inóculo para utilização futura.

Coloque o NTHI em um prato de ágar chocolate. Incube a placa de cabeça para baixo durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, cultive a bactéria em um caldo de infusão cérebro-coração.

Em seguida, em um tubo de microcentrífuga, adicione um mililitro do caldo. Gire a mistura a 4.000 g por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, rejeitar o sobrenadante e voltar a suspender o sedimento em um mililitro de PBS. Repita esta etapa de lavagem mais uma vez.

Em seguida, diluir 100 microlitros de solução ressuspensa em 900 microlitros de PBS e medir a absorbância da cultura em 600 nanômetros. Use essas informações para ajustar o inóculo para 20 milhões de UFC por mililitro.

Em seguida, determine a viabilidade e as UFC do inóculo. Cultive de uma a dez diluições em série do caldo em placas de ágar chocolate e incube as placas durante a noite.