Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiology
0 visualizações • 3:17 min. • October 30th, 2025
Comece com uma placa de ágar rica em nutrientes suplementada com tiossulfato.
Risque as cianobactérias e incube sob períodos alternados de luz e escuridão para manter o ciclo circadiano.
Durante o período de luz, a absorção de nutrientes e o tiossulfato apoiam o crescimento bacteriano e a condensação do DNA.
No período escuro, as células conservam energia e se dividem.
O ciclo alternado claro-escuro sincroniza as células com o mesmo estágio de crescimento e divisão.
Após o período de luz, adicione uma solução de sacarose e pipete repetidamente para liberar cianobactérias, causando uma mudança de cor. Transfira as células para um tubo.
Adicione um corante fluorescente específico para DNA e incube no escuro. O corante se liga ao DNA da cianobactéria.
Centrifugue para separar as cianobactérias e remover o sobrenadante.
Ressuspenda as cianobactérias em solução de sacarose, transfira a suspensão para uma lâmina e cubra-a.
Sob um microscópio de fluorescência, o DNA condensado azul nas células confirma a progressão sincronizada e regulada pelo circadiano do ciclo celular das cianobactérias.
Comece com o crescimento de cianobactérias em placas BG-11 esterilizadas de nove centímetros contendo 1,5% de ágar e 0,3% de tiossulfato de sódio. Incube as placas a 23 graus Celsius sob um ciclo de luz de 12 a 12 com 50 micro-E de luz por metro quadrado por segundo. Para manter as células, transfira-as para placas de ágar BG-11 frescas semanalmente.
Dentro de uma semana, as culturas aparecem como faixas verdes. Transfira os aglomerados verdes de células usando um laço esterilizado por chama e coloque-os na nova placa. Para observar a compactação do DNA, colete as células cultivadas por seis dias no final do período de luz.
Para liberar as células da placa, adicione um mililitro de sacarose 0,2 molar. Em seguida, colete a suspensão celular e repita a adição e remoção de sacarose até que a solução fique verde. A mudança de cor indica que a maioria das células foi liberada.
Agora, transfira 500 microlitros de solução de células suspensas para um tubo Microfuge e adicione a coloração de Hoechst para uma concentração final de um micrograma por mililitro. Em seguida, deixe as células incubarem no escuro por 10 minutos. Em seguida, gire as células, descarte o sobrenadante e ressuspenda-as em 10 microlitros de sacarose 0,2 molar.
Em seguida, transfira um microlitro da suspensão para uma lâmina de vidro, coloque uma lamínula e observe as células sob um microscópio de fluorescência equipado com um filtro UV. Usando uma objetiva de imersão em óleo 100 vezes, procure evidências de compactação de DNA, que deve ser observável na maioria das células.