Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiology
0 visualizações • 2:44 min. • October 30th, 2025
Pegue um gel SDS-PAGE contendo bandas de proteínas de partículas de nanolipoproteína de membrana. Esses complexos carregam a proteína de membrana oligomérica de Chlamydia ou MP, um antígeno vacinal promissor contra a infecção por Chlamydia .
Use bandas de proteína de MP oligomérico purificado como controle.
Monte o gel, a membrana de western blot e os componentes de blotting em um sistema de blotting seco.
Aplique uma corrente elétrica para transferir as proteínas resolvidas para a membrana.
Remover a membrana e incubá-la num tampão contendo detergentes e anticorpos primários.
Os detergentes bloqueiam locais de interação não específicos, enquanto os anticorpos primários têm como alvo o MP.
Lave a membrana para remover anticorpos primários não ligados.
Incubar com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo direcionados aos anticorpos primários.
Lave a membrana para remover o excesso de anticorpos secundários.
Capture imagens de fluorescência da membrana.
Bandas moleculares correspondentes ao MP oligomérico de controle confirmam a integridade estrutural do MP dentro dos complexos, apoiando seu potencial antigênico.
Resolva as amostras por SDS-PAGE e transfira as pilhas de gel usando um sistema comercial de dry blotting para análise de Western blot. Remova os borrões da pilha e incube-os durante a noite a quatro graus Celsius em um tampão de bloqueio contendo 0,2% de TWEEN 20 e 0,5 microgramas por mililitro MAb40, ou 0,2 microgramas por mililitro de anticorpo antiHIS-tag MAbHIS dirigido contra o HIS-tag da proteína delta-49ApoA1.
Lave cada borrão com PBST três vezes por cinco minutos por lavagem. Incube os borrões por uma hora em um tampão de bloqueio contendo anticorpo secundário conjugado a um fluoróforo em uma diluição de 1 a 10.000. Repita as lavagens com PBST e capture a imagem usando um gerador de imagens de fluorescência após a lavagem final.