Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiology
0 visualizações • 5:09 min. • October 30th, 2025
Comece com vermes C. elegans adultos estéreis, recém-mortos e com cutículas permeabilizadas, suspensas em tampão.
Esses vermes estão infectados com bactérias em seus tratos intestinais.
Pegue uma placa de poço profundo contendo partículas abrasivas no tampão e transfira um único sem-fim para cada poço.
Cubra a placa com filme de vedação e uma tampa.
Incube a placa a uma temperatura baixa para evitar o superaquecimento durante a ruptura do tecido.
Pressione a tampa para selar os poços.
Usando um disruptor de tecido, agite mecanicamente a placa. As partículas abrasivas rompem os tecidos dos vermes, liberando bactérias intestinais.
Bata na placa e centrifugue-a para pellet o conteúdo.
Misture o conteúdo para distribuir uniformemente as bactérias e, em seguida, transfira-as para poços frescos.
Diluir em série a suspensão bacteriana em tampão.
Coloque as diluições em placas de ágar e incube para permitir a formação de colônias.
Conte as colônias para quantificar a variação nas cargas bacterianas intestinais entre vermes individuais.
Para se preparar para a interrupção mecânica de vermes, obtenha uma placa estéril de dois mililitros de profundidade de 96 poços e uma tampa de placa de silicone.
Use uma espátula estéril para adicionar uma pequena quantidade de carboneto de silício estéril de grade 36 a cada poço, de modo que a grade mal cubra o fundo do poço. Adicione 180 microlitros de tampão sem-fim M9 a cada poço. Rotule as colunas e linhas e, em seguida, cubra a placa frouxamente com a tampa da placa de silicone.
Em seguida, transfira os vermes permeabilizados para uma pequena placa de Petri com M9TX-01 preenchido até uma profundidade de um centímetro. Usando um microscópio de dissecação, pipete vermes individuais em volumes de 20 microlitros e transfira-os para poços individuais da placa de 96 poços. Para ejetar quaisquer vermes presos à pipeta, aspire 20 microlitros de M9TX-01 de uma área clara da placa de Petri e solte-o de volta na placa. Depois que todos os vermes forem transferidos, cubra a placa de 96 poços com uma folha de filme de vedação flexível com o lado de papel voltado para baixo nos poços de amostra.
Coloque a esteira de vedação de silicone levemente em cima do filme de vedação flexível sem pressionar a tampa nos poços. Coloque a placa a quatro graus Celsius por 30 a 60 minutos para evitar o superaquecimento durante a interrupção. Depois de resfriar a placa, pressione a esteira de vedação de silicone firmemente nos poços para selá-los.
Em seguida, prenda as placas no disruptor de tecido. Agite as placas por um minuto a 30 hertz. Em seguida, gire as placas em 180 graus e repita a agitação por um minuto.
Bata as placas firmemente na bancada duas ou três vezes para desalojar qualquer grão do filme de vedação flexível. Centrifugue as placas a 2.400 vezes g por dois minutos para coletar as amostras no fundo dos poços. Em seguida, remova a tampa de silicone e retire o filme de vedação.
Para preparar a diluição em série de dez vezes mais do verme digerido, encha 180 microlitros de um X PBS nas fileiras B a D de uma placa de 96 poços. Usando um pipetador de vários poços ajustado para 200 microlitros, misture lentamente o digestor de vermes pipetando. Transfira a quantidade máxima do líquido para a linha A da placa de 96 poços contendo PBS.
Usando uma pipeta multicanal, remova 20 microlitros da linha superior e dispense na linha B, seguido de mistura. Repita esta etapa para as linhas B a C e, em seguida, para as linhas C a D para obter uma diluição de 1000 vezes. Para quantificação bacteriana de vermes monocolonizados, colocar 10 a 20 microlitros de cada diluição em placas de ágar sólido. Para colonização multiespécie, coloque 100 microlitros de cada diluição em placas de ágar de 10 centímetros.