Análise precisa e de alta capacidade do crescimento bacteriano usando um leitor de microplacas

Comece com bactérias preservadas em um estoque de glicerol, previamente crescidas até a fase exponencial inicial para garantir estados fisiológicos uniformes e crescimento reprodutível.

Adicione meio de crescimento e vórtice para ressuspender uniformemente as bactérias.

Dilua serialmente a suspensão usando meio fresco para obter uma faixa de densidades celulares iniciais.

Carregue as amostras nos poços internos de uma placa multipoço, deixando os poços de borda preenchidos com meios em branco para minimizar a variabilidade relacionada à evaporação.

Coloque a placa em um leitor de microplacas para manter o tremor constante e uma temperatura ideal para o crescimento bacteriano.

À medida que as bactérias se multiplicam, a densidade óptica ou OD da cultura aumenta.

Meça o OD em intervalos fixos.

Subtraia os valores iniciais de OD obtidos dos poços em branco para corrigir a absorção de fundo.

Depois, calcule a taxa de crescimento a partir de valores consecutivos de OD medidos em intervalos de tempo definidos, permitindo uma quantificação precisa e de alta produtividade da dinâmica do crescimento bacteriano.

Para registrar o crescimento em tempo real, adicione aproximadamente 25 mililitros de M63 a um reservatório de reagente esterilizado. Depois, adicione 900 microlitros de M63 aos microtubos em preparação para a realização de diluições seriadas. Em seguida, adicione 900 microlitros de M63 ao estoque de glicerol descongelado e ao vórtice.

Transfira 100 microlitros da diluição 10 vezes para outro microtubo contendo 900 microlitros de M63 e vórtice. Repita essa etapa até atingir o número desejado de diluições. Agora, encha os poços na borda de uma microplaca de fundo plano esterilizada de 96 poços com 200 microlitros de M63, usando uma pipeta de oito canais.

Carregue 200 microlitros de cada amostra diluída nos poços das microplacas de acordo com a tabela de referência. Para evitar camadas de alocação devido ao aquecimento e à eficiência de semeadura, nunca use os poços na borda da microplaca para suas amostras e carregue a mesma amostra em múltiplos poços em locais variados da microplaca. Coloque a microplaca de 96 poços no leitor de placa.

Abra Ler Agora no Gerenciador de Tarefas e escolha o programa. Clique em Ok para começar a medir. Por fim, salve a gravação como um novo arquivo experimental para análise de dados.