Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiology
0 visualizações • 3:17 min. • November 28th, 2025
Comece com um ágar macio derretido mantido em temperatura quente.
Inocule uma cultura de Pseudomonas syringae , a cepa teste, no ágar.
Depois, faça um vórtice breve para distribuir as células de forma uniforme.
Despeje a mistura sobre uma placa de ágar solidificada e espalhe uniformemente.
Feche a tampa e deixe solidificar.
Avistar um sobrenadante filtrado na superfície do ágar solidificado.
O sobrenadante contém bacteriocina, uma molécula antibacteriana derivada de uma cepa doadora induzida por estresse, P. syringae .
Incube a placa para permitir o crescimento bacteriano e a difusão da bacteriocina através do ágar.
A bacteriocina se liga a receptores específicos da superfície da cepa testada e desintegra sua membrana, levando à morte celular.
Isso resulta na formação de uma zona clara no ágar, indicando a área onde a cepa de teste foi eliminada pela molécula antibacteriana bacteriocina.
Dilua a cultura de 1 a 100 KB frescos. Incube a cultura por três a quatro horas com agitação em temperatura ambiente. Em seguida, prepare ágar aquático esterilizado autoclavando uma suspensão de ágar em água ultrapura.
Mantenha o ágar mole derretido em um banho-maria a 60 graus Celsius antes do uso. Utilizando uma pipeta sorológica estéril, transfira três mililitros de ágar mole para um tubo de cultura estéril. Retorne o tubo de cultura ao banho-maria para mantê-lo em estado de fusão.
Antes de despejar a sobreposição, deixe o ágar derretido esfriar, mas não deixe que solidifique.
É fundamental que o ágar seja mantido em um estado quente e completamente derretido antes da inoculação. Se não, a sobreposição terá uma aparência granulada e será mais difícil de interpretar.
Em um capuz estéril, inocule 100 microlitros da cultura da cepa testadora no ágar mole e no vórtice para misturar. Gire a cultura manualmente por 10 a 15 segundos e depois despeje sobre a base de uma placa de ágar. Incline a placa em todas as direções para garantir que o ágar mole cubra uniformemente o ágar inferior.
Cubra o prato e deixe de 20 a 30 minutos solidificar. Tenha cuidado para não mexer na placa durante a solidificação. Uma vez solidificado, coloque de dois a cinco microlitros de sobrenadante sobre a sobreposição.
Deixe as placas incubarem durante a noite em temperatura ambiente. Observe e registre os resultados na manhã seguinte. Usando esse método, duas cepas de P. syringae são inibidas por diferentes bacteriocinas. A Cepa A é sensível a uma bacteriocina de alto peso molecular, a tailocina, mas não sensível a uma bacteriocina alternativa de baixo peso molecular.