Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiology
0 visualizações • 4:04 min. • November 28th, 2025
Pegue uma amostra de água do mar contendo diversos microrganismos, incluindo bactérias que degradam poluentes ambientais.
Dilua serialmente a amostra para reduzir a densidade microbiana e a coloque em um meio nutritivo.
Após a incubação, selecione colônias morfologicamente distintas, que ainda podem abrigar tipos bacterianos geneticamente e metabolicamente diversos.
Rastree cada colônia selecionada para dispersar células individuais e incubar.
Cada célula forma uma colônia, representando um isolado bacteriano geneticamente puro com um perfil metabólico distinto.
Inocule cada isolado em meio de crescimento e incube para aumentar a biomassa.
Centrifuge a cultura, descarte o sobrenadante e lave com um tampão para remover o meio residual.
Resuspenda as células no tampão e inocule-as em um meio seletivo contendo EE2, um poluente ambiental.
Como única fonte de carbono no meio, o EE2 seleciona bactérias que podem metabolizá-lo para obter energia e crescimento.
A turbidez no meio indica crescimento bacteriano, confirmando o isolamento do isolado bacteriano degradante de poluentes.
Para selecionar bactérias, primeiro realize diluições seriadas de até 10 a menos nove em solução salina estéril para amostras de coral e até 10 a menos seis para amostras de água. A pipeta dilui cinco vezes antes de descartar a ponta.
Depois, vórtice cada um. Faça vórtice nas amostras por cinco segundos a cada vez antes de realizar a próxima diluição seriada. Pipete 100 microlitros de cada diluição em placas de Petri contendo 3% de cloreto de sódio para caldo de lisogênia e as coloque em placas.
Incube as placas por um a três dias na temperatura alvo, por exemplo, 26 graus Celsius. Confira as placas uma vez por dia. Selecione e isole as colônias que apresentam morfologias de crescimento distintas em novas placas usando a técnica de placas de estria.
Repita essa etapa quantas vezes for necessário para que colônias puras crescam nas placas. Armazene os isolados a quatro graus Celsius ou em glicerol conforme descrito no manuscrito. Para realizar o teste de capacidade de degradação EE2, retire uma única colônia das placas frescas e inocule dois mililitros de meio LB estéril em um tubo.
Se for um estoque de glicerol, pegue 10 microlitros de caldo bacteriano glicerol e passe em placas de ágar LB. Incube entre 24 e 28 graus Celsius durante a noite para que colônias individuais cresçam. Coloque o tubo contendo o médio LB inclinado sob agitação constante a 150 vezes g a 24 a 28 graus Celsius durante a noite.
Após o crescimento bacteriano, faça pellets nas células centrifugando-as a 8.000 vezes g por oito minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernadante. Para lavar o caldo LB restante, adicione dois mililitros de água salina para resuspender as células.
Repita a lavagem duas vezes para garantir que não haja vestígios de fonte de carbono. Inocule as células lavadas e ressuspensas em meio de cultura Bushnell Haas mínimo contendo EE2 como única fonte de carbono. Avalie o crescimento bacteriano por densidade óptica a 600 nanômetros e nossas unidades de formação de colônias em meio ágar LB após 16 a 72 horas de incubação.