Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiology
0 visualizações • 2:43 min. • November 28th, 2025
Teste células humanas que expressam CaeB, uma proteína bacteriana antiapoptótica.
Use células que não tenham CaeB como controle.
Introduza um reagente de transfecção complexo com um sistema de expressão gênica induzível por tetraciclina, contendo plasmídeos reguladores e de resposta.
O plasmídeo regulador codifica um ativador e silenciador transcricional, enquanto o plasmídeo de resposta codifica uma proteína pró-apoptótica controlada por TRE.
Incubar as células para facilitar a absorção de plasmídeos e a expressão reguladora de proteínas.
Sem tetraciclina, o ativador permanece inativo, e o silenciador reprime a transcrição conduzida por TRE.
Adicione um análogo de tetraciclina e incube.
O análogo permite a ligação ativador–TRO, iniciando a expressão proteica pro-apoptótica.
Nas células de controle, isso desencadeia sinalização apoptótica, ativando um marcador apoptótico.
Em células que expressam CaeB, CaeB inibe a sinalização apoptótica, reduzindo a ativação do marcador.
Uma ativação reduzida dos marcadores em células que expressam CaeB sugere que CaeB inibe a apoptose.
Comece esse procedimento semeando células HEK293 que expressam GFP ou GFP-CaeB de forma estável em uma placa de 12 poços com uma densidade de 100.000 células por poço.
Em seguida, prepare o reagente de transfecção de DNA e polietilenimina separadamente em 75 microlitros de meio Opti-MEM e incube por cinco minutos em temperatura ambiente. Para formação complexa, incube ambas as misturas juntas por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, adicione a solução de DNA de polietilanina em gota às células e incube a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.
Cinco horas após a transfecção, induz-se a expressão das proteínas apoptóticas adicionando um micrograma por mililitro de doxiciclina ao meio de cultivo. Depois, incube as células por 18 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.