Detecção por PCR de patógenos transmitidos por alimentos a partir de amostras enriquecidas de moscas

Coloque os tubos de reação em cadeia da polimerase ou PCR contendo comprimidos prontos para PCR, específicos para os patógenos alimentícios alvo, em um suporte refrigerado para tubos de PCR.

Cada comprimido inclui primers específicos para o alvo, DNA polimerase, dNTPs e um corante fluorescente usado na reação de PCR.

Adicione lisato de mosca enriquecido contendo uma grande quantidade de DNA de bactérias patogênicas para formar a mistura de reações.

Sele os tubos com tampas ópticas para evitar a evaporação.

Carregue os tubos de PCR no ciclador térmico e realize execuções de PCR separadas usando programas específicos para cada patógeno alvo.

Durante a PCR, o DNA se desnatura, os primers se ligam à sequência alvo, e a amplificação produz DNA de fita dupla que liga o corante e emite fluorescência.

Ciclos repetidos resultam em amplificação exponencial do DNA e aumento da fluorescência.

O instrumento acompanha a fluorescência em tempo real para detectar a presença dos patógenos alimenticios alvo na amostra.

Para iniciar a detecção baseada em PCR, primeiro, resfrie um rack de tubos de PCR em um bloco de resfriamento. Em seguida, coloque os tubos de PCR correspondentes contendo comprimidos prontos para PCR do patógeno alimentar alvo no suporte.

Remova cuidadosamente as tampas dos tubos de PCR usando a ferramenta de descapsulação e descarte-as. Verifique se cada tubo contém um comprimido. Depois, transfira 50 microlitros de lisado para os tubos de PCR apropriados.

Fixe novos capacitores ópticos nos tubos de PCR usando a ferramenta de capacitação. Após montar as reações, carregue os tubos de PCR no sistema de detecção do ciclador de PCR. Depois, execute o programa e visualize os resultados conforme descrito no protocolo do fabricante.