Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Biological Techniques
0 visualizações • 3:37 min. • July 8th, 2025
Os osteoblastos são células formadoras de osso que secretam pequenas vesículas em sua matriz extracelular, a MEC. Essas vesículas, chamadas vesículas de matriz, são equipadas com transportadores de membrana e enzimas que permitem a entrada de íons cálcio e fosfato, formando cristais minerais em seu interior. À medida que os cristais se acumulam, eles rompem a membrana da vesícula para formar nódulos mineralizados na MEC, compondo a densidade mineral óssea.
Para visualizar a mineralização, comece com células osteoblásticas em um andaime biocompatível em um meio de crescimento adequado. Os osteoblastos se ligam ao andaime e usam fatores de crescimento do meio para secretar vesículas da matriz que posteriormente formam nódulos mineralizados na MEC.
Aspire o meio de cultura e lave as células para remover quaisquer vestígios de meio. Trate as células com uma solução de formalina, que induz a reticulação da MEC, fixando e preservando a estrutura do tecido. Lave as células para remover qualquer formalina restante.
Em seguida, adicione a solução de coloração de vermelho de alizarina e incube a cultura. As moléculas de corante se ligam ao nódulo mineralizado e se associam ao cálcio, um mineral ósseo chave, formando grandes complexos corados.
Aspire a solução de coloração e lave bem para remover qualquer corante não ligado. Quando observados ao microscópio, os depósitos minerais ricos em cálcio aparecem como nódulos vermelho-brilhantes na MEC, indicando mineralização pelos osteoblastos.
Aspirar meio de cultura de osteoblastos primários, 14 dias após a adição do meio de mineralização osteogênica. Enxágüe duas vezes com 0,5 mililitros de 1X PBS. Em seguida, fixe as células adicionando 0,5 mililitros de solução de formalina tamponada a 10% e incubando em temperatura ambiente por 10 minutos. Após 10 minutos, aspire a formalina tamponada a 10% com uma pipeta descartável e lave duas vezes com 0,5 mililitros de água ultrapura. Em seguida, adicione 250 microlitros de solução de coloração 40 milimolares de vermelho de alizarina S aos osteoblastos fixos e incube a placa em temperatura ambiente por 10 minutos em um agitador a 100 batidos por minuto.
Após a incubação com solução de coloração, aspire a solução de coloração com uma pipeta descartável e enxágue com 1 mililitro de água ultrapura. Repita esta etapa 5 a 10 vezes até que a solução de enxágue saia transparente para remover manchas inespecíficas. Depois de aspirar a lavagem final, adicione 1 mililitro de PBS frio e incube a placa em temperatura ambiente por 10 minutos em uma coqueteleira como antes. Em seguida, transfira o disco de fosfato beta-tricálcico corado para um novo poço e escaneie as placas com um scanner de mesa para registrar a mineralização.