Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Biological Techniques
0 visualizações • 3:31 min. • July 8th, 2025
Os ácidos siálicos, como o ácido N-acetilneuramínico e o ácido N-glicolilneuramínico, são porções de carboidratos carregadas negativamente encontradas nas extremidades distais das cadeias de oligossacarídeos na superfície celular de mamíferos.
Para quantificar as quantidades relativas desses ácidos siálicos no tecido hepático de camundongos usando cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa ou RP-HPLC, primeiro trate a mistura isolada de ácido siálico com agente de derivatização. O agente de derivatização interage com os grupos funcionais dos ácidos siálicos, gerando derivados estáveis e fluorescentes do ácido siálico.
Monte uma coluna RP-HPLC, conectada a um detector de fluorescência. A coluna compreende fase estacionária à base de sílica porosa ligada a ligantes de cadeia alquílica hidrofóbicos não polares para facilitar interações seletivas com derivados de ácido siálico durante a execução cromatográfica.
Equilibre a coluna usando a fase móvel polar aquosa contendo baixas concentrações de acetonitrila, um solvente orgânico menos polar, para um condicionamento ideal da coluna.
Colocar a mistura de ácido siálico derivatizado na coluna.
O ácido N-acetilneuramínico, contendo um grupo N-acetil hidrofóbico, adsorve mais fortemente os ligantes hidrofóbicos da fase estacionária do que o ácido N-glicolilneuramínico com um grupo N-glicolitil hidrofílico.
Analise as amostras, usando um sistema HPLC padrão conectado a um detector de fluorescência online. Use uma coluna C-18 de fase reversa com 250 milímetros de comprimento e 4,6 milímetros de diâmetro para a análise.
Depois de preparar o solvente A e o solvente B e configurar a execução de HPLC conforme detalhado no protocolo de texto, injete 50 microlitros da amostra no sistema de HPLC.
Monitore os eluentes, usando o comprimento de onda de excitação do detector de fluorescência de 373 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 448 nanômetros.
Finalmente, calcule a quantidade relativa de Neu5Gc conforme descrito no protocolo de texto.