Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Biological Techniques
0 visualizações • 3:20 min. • July 8th, 2025
A reação em cadeia da polimerase aninhada, PCR aninhada, pode amplificar seletivamente sequências de genes específicos.
Para detectar uma sequência viral alvo, comece com uma mistura mestre contendo primers externos complementares a uma região de DNA maior contendo a sequência viral alvo, dNTPs e DNA polimerase termoestável em um tampão apropriado.
Adicione DNA viral de fita dupla, extraído das células infectadas pelo vírus, a essa mistura. Transfira o tubo para um termociclador; execute o primeiro ciclo de PCR.
Durante a desnaturação, o DNA de fita dupla produz dois modelos de fita simples. A uma temperatura de recozimento apropriada, os primers externos se ligam às sequências-alvo correspondentes. Posteriormente, a DNA polimerase estende os primers usando dNTPs, produzindo grandes amplicons, contendo a sequência específica dentro do DNA amplificado.
Transfira esses amplicons para um novo tubo. Complemente com uma mistura master fresca contendo primers internos ou aninhados visando uma sequência menor e mais específica dentro do DNA amplificado maior. Execute o segundo PCR.
Durante a segunda PCR, a fita de DNA se desnatura. Após a desnaturação, os primers aninhados se ligam aos locais-alvo no molde de fita simples, seguido pela extensão do primer mediada pela polimerase.
Repita o segundo ciclo de PCR várias vezes para amplificar exclusivamente a sequência viral alvo.
Analise o produto da PCR para visualizar os amplicons menores, confirmando a presença da sequência viral específica.
Recupere os reagentes necessários e mantenha-os no gelo em uma sala limpa até que estejam prontos para uso. Quando estiver pronto, descongele e vortex os reagentes. Em seguida, prepare 48 microlitros de mistura de PCR de primeira rodada para cada amostra em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, conforme descrito na Tabela 2 do protocolo de texto, e divida a mistura de reação em tubos de PCR de 0,2 mililitro.
Em uma estação de trabalho de PCR em uma sala de modelos, adicione uma amostra de 2 microlitros do cDNA à mistura de PCR da primeira rodada. Inclua dois microlitros de cDNA CVS-11 como controle positivo e dois microlitros de água bidestilada como controle negativo. Em seguida, transfira os tubos selados para um termociclador PCR e cicle usando os parâmetros listados na Tabela 3 do protocolo de texto.
Para começar, prepare 48 microlitros de mistura de PCR de segunda rodada para cada amostra em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, conforme descrito na Tabela 4 do protocolo de texto, e divida a mistura de reação em tubos de PCR de 0,2 mililitro. Adicione dois microlitros do produto de PCR de primeira rodada à mistura de PCR de segunda rodada. Incluir água bidestilada como controlo negativo para esta ronda de PCR. Em seguida, execute o ciclo térmico de PCR usando os parâmetros listados na Tabela 3 do protocolo de texto.