Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Immunology
0 visualizações • 3:06 min. • July 8th, 2025
Comece com uma placa contendo uma cultura de macrófagos primários.
Introduza lipopolissacarídeo bacteriano, LPS, que se liga a receptores toll-like em macrófagos, desencadeando a regulação positiva da proteína NLR contendo domínio de pirina 3 ou NLRP3.
Adicione um ionóforo que medeia o efluxo de íons de potássio. A diminuição do potássio citosólico ativa o NLRP3. O NLRP3 ativado oligomeriza e induz o recrutamento de uma proteína adaptadora, que por sua vez recruta pró-caspase-1, formando um inflamassoma.
A autoproteólise converte a pró-caspase-1 em caspase-1 ativa, que medeia a morte celular inflamatória ou piroptose. Danos ao DNA durante a piroptose levam à condensação nuclear.
Fixe as células e trate com um detergente para permeabilizá-las.
Adicione um anticorpo primário que se liga à proteína adaptadora associada ao inflamassoma e um anticorpo secundário marcado com fluorescência que se liga ao anticorpo primário, marcando o inflamassoma.
Introduza uma coloração fluorescente de ácido nucleico para rotular o núcleo. Sob um microscópio de fluorescência, as células exibem núcleos condensados - indicando piroptose - e focos de proteínas adaptadoras - indicando a formação de inflamassoma.
Para análise imunofluoroquímica das células tratadas com nigericina, lave as células marcadas com sonda e incube as células em 250 microlitros de solução de fixação e permeabilização por poço por 30 minutos em gelo, protegidas da luz.
Lave os macrófagos mais três vezes com tampão de lavagem fresco e rotule as células com 250 microlitros de anticorpo primário contra a proteína semelhante a speck associada à apoptose contendo um domínio de recrutamento de caspase C-terminal, ou ASC, por poço por uma hora no gelo.
Lave as células no final da incubação e rotule as amostras com 250 microlitros do anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente apropriado por mais uma hora no gelo, adicionando 4 microlitros de um corante nuclear fluorescente apropriado durante os últimos 5 minutos.
Depois de lavar as células 3 vezes em tampão de lavagem a frio, monte lamínulas nas lâminas com 7 microlitros de meio de montagem anti-desbotamento, conforme demonstrado, e visualize os macrófagos por microscopia confocal de fluorescência.