Geração de progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias em culturas monocamada sem soro

Comece com uma cultura de células-tronco embrionárias de camundongo.

Lave as células com um tampão para remover mídia e detritos celulares.

Adicione um coquetel de enzimas para separar as células da superfície do frasco.

Adicione meios para interromper a atividade enzimática e coletar as células em um tubo. Centrifugue e descarte o sobrenadante contendo enzimas.

Ressuspenda as células em meios de cultura neuronais sem soro.

Semeie as células em poços de placa de vários poços revestidos de gelatina.

incubar. As células-tronco embrionárias aderem à superfície revestida de gelatina. Os constituintes do meio, incluindo nutrientes, fatores de crescimento e hormônios, facilitam a proliferação celular e formam uma monocamada.

Nessa densidade celular, as células-tronco embrionárias produzem e liberam níveis ideais de fatores de crescimento e citocinas.

Essas moléculas desencadeiam vias de sinalização intracelular, facilitando a diferenciação de células-tronco embrionárias em progenitores neurais.

Misture a gelatina com 500 mililitros de PBS quente e cubra o fundo do recipiente de cultura de células com apenas o suficiente da solução para revestir a superfície. Enquanto a gelatina é revestida, enxágue a cultura subconfluente de células-tronco embrionárias de camundongo duas vezes em PBS. Em seguida, adicione 1 mililitro de reagente de dissociação à cultura.

Após dois a cinco minutos, bata no recipiente para desalojar a monocamada em uma suspensão unicelular e colete a cultura em um total de 10 mililitros de meio e reagente de dissociação celular.

Transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros e gire-as em uma centrífuga. Em seguida, após uma aspiração cuidadosa do sobrenadante, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de pipetagem N2B27 pré-aquecida contra a lateral do tubo para evitar a criação de bolhas.

Agora, conte as células que registram a concentração e ressuspenda-as no número apropriado de células por unidade de volume por poço em N2B27 pré-aquecido de acordo com a tabela. Em seguida, aspire a gelatina do recipiente de cultura e coloque as células em placas sem girar o recipiente.

Coloque as culturas em uma incubadora úmida a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, substituindo o meio a cada um ou dois dias por N2B27 fresco.