Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neuroscience
0 visualizações • 3:03 min. • July 8th, 2025
Tome células-tronco embrionárias de camundongo suspensas em meio sem soro contendo inibidores de pequenas moléculas.
Semeie as células em uma placa de cultura não aderente, permitindo que elas proliferem e se agreguem para formar corpos embrióides tridimensionais ou EBs.
Além disso, os inibidores bloqueiam as vias de sinalização não neuronais e induzem a diferenciação de células-tronco embrionárias em direção a um destino neural cortical.
Transfira os EBs para um tubo, centrifugue e remova o sobrenadante.
Ressuspenda os EBs em uma solução contendo um coquetel de enzimas e DNase.
As enzimas dissociam os EBs em células únicas, enquanto a DNase degrada o DNA contaminante.
Adicione meios sem soro contendo inibidores para interromper a atividade enzimática e, em seguida, centrifugue e remova o sobrenadante contendo enzimas.
Ressuspenda as células em meios contendo inibidores de moléculas pequenas e transfira-as para placas de cultura revestidas com fatores de adesão.
As células se ligam à superfície da placa revestida.
Os inibidores previnem a morte celular apoptótica e induzem a diferenciação celular em progenitores interneurônios corticais.
Comece a cultivar as células como corpos embrióides adicionando 75.000 células por mililitro em meio KSRN2 nas placas de cultura de tecidos não aderentes e incube-as a 37 graus Celsius. No DD1, prepare-se para o pouso celular revestindo as placas tratadas com cultura de tecidos com poli-L-lisina por pelo menos uma hora ou durante a noite a 37 graus Celsius.
Em DD2, aspire a poli-L-lisina e cubra as placas com laminina durante a noite a 37 graus Celsius. No DD3, antes de iniciar a dissociação da EB, aspire a laminina e deixe as placas secarem completamente em uma capa de cultura de tecidos.
Em seguida, transfira os EBs com o meio para um tubo de 15 mililitros e centrifugue por três a quatro minutos a 15 vezes g ou até que os EBs tenham sido peletizados. Aspire o meio e adicione 3 mililitros de solução de descolamento celular contendo DNase. Em seguida, incube a amostra a 37 graus Celsius por 15 minutos.
Agite suavemente o tubo a cada três minutos para ajudar na dissociação EB. Quando os EBs não estiverem mais visíveis ou 15 minutos tiverem decorrido, adicione 6 mililitros de KSRN2 contendo DNase e centrifugue por cinco minutos a 200 vezes g. Em seguida, coloque as células em KSRN2 contendo LDN193189, XAV939 e o inibidor de ROCK Y27632 a 4,5 a 5 x 104 células por centímetro quadrado.