Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neuroscience
0 visualizações • 3:45 min. • July 8th, 2025
Pegue um cérebro suíno.
Remova as meninges, a membrana protetora que cobre o cérebro, para evitar a contaminação das células meníngeas.
Raspe a substância cinzenta, uma região rica em capilares, e colete o tecido em uma placa de cultura contendo meios.
Passe a substância cinzenta por uma seringa sem agulha para fragmentar o tecido.
Transfira os fragmentos para um homogeneizador e homogeneize para desintegrar ainda mais o tecido, liberando os capilares cerebrais.
Passe o homogeneizado por um filtro com um tamanho de poro específico para reter os capilares, permitindo que outras células cerebrais fluam.
Coloque o filtro em uma solução contendo enzimas e DNase.
As enzimas desprendem as células aderentes, enquanto a DNase degrada o DNA contaminante, facilitando o isolamento dos capilares puros.
Lave os capilares do filtro.
Adicione meios contendo proteínas séricas para inativar as enzimas.
Transfira os capilares para um tubo, centrifugue e remova o sobrenadante. Ressuspenda os capilares puros em meio fresco para análise posterior.
Para iniciar este procedimento, coloque os cérebros em uma bancada de fluxo estéril e lave-os suavemente com 1 litro de PBS em um béquer colocado no gelo. Em seguida, remova cuidadosamente as meninges de cada cérebro usando uma pinça de ponta fina. Usando um bisturi, raspe a massa cinzenta do cérebro, uma de cada vez, e transfira o material isolado para placas de Petri contendo 20 mililitros de DMEM / F12 colocados no gelo.
Para a fragmentação inicial, passe o material de substância cinzenta por uma seringa de 50 mililitros sem a agulha. Repita o procedimento para todos os cérebros e agrupe o material de matéria cinzenta coletado. Transfira o material isolado de substância cinzenta com meio DMEM/F12 para o tubo triturador de um homogeneizador de tecidos portátil. Homogeneizar o material fazendo 8 pinceladas para cima e para baixo com um pilão solto, seguidas de 8 pinceladas para cima e para baixo com um pilão apertado.
Em seguida, isole os capilares filtrando o homogenato usando um frasco de tampa azul de 500 mililitros com porta-filtro e malha de filtro de 140 mícrons. Coloque os filtros capilares em placas de Petri com a solução de digestão. Em seguida, incubar as placas de Petri a 37 graus Celsius durante uma hora num agitador orbital a 180 RPM ou agitá-las suavemente a cada 10 minutos.
Após uma hora, lave os capilares dos filtros com suspensão da placa de Petri. Em seguida, divida a suspensão dos três pratos em dois tubos de 50 mililitros e interrompa a digestão adicionando 10 mililitros de DMEM/F12 a cada tubo de 50 mililitros.
Centrifugue as suspensões celulares a 250 vezes g, 4 graus Celsius por 5 minutos. Em seguida, aspirar os sobrenadantes e ressuspender cada pellet em 10 mililitros de DMEM/F12. Em seguida, adicione mais 20 mililitros de DMEM/F12 a cada tubo.