Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neuroscience
0 visualizações • 3:20 min. • July 8th, 2025
Comece adicionando uma suspensão de células endoteliais do cérebro de camundongo à inserção da membrana permeável de uma placa transwell.
Adicione um meio de crescimento ao poço inferior e incube.
Os fatores de crescimento e nutrientes no meio ajudam as células a crescer como uma monocamada.
Remova o meio do fundo e do inserto.
Lave as superfícies interna e externa do inserto para remover quaisquer detritos.
Adicione um meio aderente à inserção e transfira a inserção para um poço revestido com matriz contendo células-tronco neurais corticais primárias e progenitoras, ou NSPCs, e incuba.
Adicione o azidoaçúcar, um análogo precursor do ácido siálico não natural, às células endoteliais e aos NSPCs e incube.
As citocinas e quimiocinas secretadas pelas células endoteliais promovem o crescimento das NSPCs em grandes clones semelhantes a folhas.
Os azidoaçúcares se integram às estruturas sialoglicanos na superfície celular do NSPC, marcando a glicoproteína. Isso permite a identificação de proteínas de superfície celular nos NSPCs expandidos.
Para preparar as células endoteliais, ressuspenda um pellet de células BEND3 de uma placa de Petri de 0,10 centímetro a 90% de confluência com 9 mililitros de meio celular BEND3. Adicione 1 mililitro da suspensão celular em uma inserção de suporte permeável. Adicione mais 2 mililitros de meio BEND3 por poço na câmara inferior da matriz. Continue a cultivar as células por um dia a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Um dia após o revestimento das células nas inserções, aspire suavemente o meio, primeiro da câmara inferior e depois das inserções. Lave a face das pastilhas três vezes com DMEM pré-aquecido. Lave a superfície externa das inserções enxaguando com DMEM pré-aquecido. Em seguida, adicione 1 mililitro de AM pré-aquecido em uma inserção. Transfira as inserções para os poços com células corticais primárias. Incube a co-cultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 12 horas.
Dissolver Ac4ManNAz em DMSO para atingir uma concentração de estoque de 200 milimolares. Recupere a placa de co-cultura endotelial neural da incubadora. Adicione 1 microlitro do estoque de Ac4ManNAz a cada câmara inferior e 0,5 microlitros por inserção na co-cultura. Cultive as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 5 dias. Enquanto as células estão em cultura, adicione 100 microlitros de RM por inserção e 200 microlitros de RM por câmara inferior para realimentar as células endoteliais e neurais a cada dois dias.