Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neuroscience
0 visualizações • 3:14 min. • July 8th, 2025
Transfira um pedaço de tecido cerebral humano fresco congelado para um moedor adequado contendo tampão de lise fria.
Mova o pilão para cima e para baixo para quebrar mecanicamente o tecido, liberando as células.
As moléculas de detergente no tampão de lise abrem a membrana celular, liberando os núcleos.
Transfira o conteúdo para um tubo de centrífuga adequado e adicione tampão de sacarose frio no fundo do tubo, criando um gradiente de densidade.
Centrifugue em alta velocidade para separar os núcleos no fundo do tubo.
Rejeitar o sobrenadante e ressuspender os núcleos numa solução salina tamponada.
Adicione anticorpos conjugados com fluoróforo específicos do alvo aos núcleos e incube para permitir que o anticorpo se ligue à sua proteína nuclear alvo.
Adicione corante de coloração nuclear para visualizar o DNA intacto.
Realize a classificação de núcleos ativados por fluorescência para classificar os núcleos de diferentes populações de células com base em sinais de fluorescência distintos.
Comece a dissecar aproximadamente 200 a 400 miligramas de tecido de uma amostra de tecido do córtex adulto humano fresco e congelado. Coloque o tecido em um Douncer de tecido de vidro de 7 mililitros contendo 4 mililitros de tampão de lise gelada no gelo e triture o tecido aproximadamente 50 vezes.
Transferir o homogeneizado para um tubo de polipropileno ultracentrífugo de 12 mililitros. Use uma pipeta de 5 mililitros para adicionar 6,5 mililitros de tampão de sacarose gelada ao fundo do tubo de ultracentrífuga sem perturbar a interface entre a sacarose e o homogeneizado tecidual.
Para coletar os núcleos, ultracentrifugar o lisado por uma hora a 101.814 vezes g e aspirar cuidadosamente o sobrenadante e os detritos sem perturbar o pellet. Adicione PBS ao tubo de ultracentrífuga, ressuspendendo o pellet de núcleos.
Para a classificação ativada por fluorescência dos núcleos isolados, adicione aproximadamente 20 microlitros da amostra ressuspensa a uma solução de anticorpos contendo anticorpo anti-NeuN de camundongo conjugado com AlexaFlour555. Adicione aproximadamente 20 microlitros da amostra ressuspensa a uma solução de anticorpo contendo anticorpo anti-PAX6 de camundongo conjugado com APC. Após uma incubação de uma hora, a 4 graus Celsius com agitação protegida da luz, adicione DAPI na proporção de 1 para 1.000 a todas as amostras e controles.