Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neuroscience
0 visualizações • 3:47 min. • July 8th, 2025
Pegue tecidos cerebrais isquêmicos de camundongos perfundidos contendo células cerebrais e células imunes infiltradas.
Pique os lenços em uma peneira e enxágue com tampão.
Centrifugar o filtrado e rejeitar o sobrenadante.
Ressuspenda o pellet em uma solução de enzima digestiva e transfira-o para um tubo de microcentrífuga.
Incube para que as enzimas digestivas quebrem a matriz extracelular, soltando as células.
Filtre a suspensão e enxágue com tampão contendo DNase para remover o DNA contaminante.
Em seguida, lave com tampão sem DNase.
Centrifugar o filtrado e rejeitar o sobrenadante.
Ressuspenda as células no meio gradiente de densidade. Em seguida, transfira o conteúdo para um novo tubo e misture. Centrifugue para separar os componentes por densidade.
Remova o sobrenadante contendo mielina e detritos.
Ressuspenda o pellet em tampão sem DNase. Transfira para um novo tubo e centrifugue novamente.
Rejeitar o sobrenadante para assegurar uma remoção suficiente do meio de gradiente de densidade.
Finalmente, ressuspenda as células no tampão para análise posterior.
Usando a extremidade do êmbolo de uma seringa de 5 mililitros, amasse os pedaços de tecido cerebral através de um filtro de células de 100 mícrons, enxaguando continuamente o filtro com HBSS gelado com cálcio e magnésio. Em seguida, coloque os tecidos homogeneizados no gelo.
Quando todas as amostras tiverem sido processadas, gire as suspensões celulares. E descarte cuidadosamente os sobrenadantes. Ressuspenda os pellets em 1 mililitro de tampão de digestão. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de 2 mililitros.
E incubar as células sob rotação lenta e contínua a 37 graus Celsius. Após uma hora, peneire a suspensão celular através de um filtro de células de 70 mícrons. E enxágue bem o filtro com 3 mililitros de tampão de lavagem contendo DNase. Em seguida, lave o filtro com 15 mililitros de tampão de lavagem sem DNase. Gire as células e descarte o sobrenadante.
Para remover os detritos celulares e a mielina, ressuspenda as células em 5 mililitros de temperatura ambiente com gradiente de densidade de 25% e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Misture bem as células e o gradiente com pipetagem suave repetida. Em seguida, gire para baixo a solução celular.
No final da separação, aspire cuidadosamente o revestimento de mielina e o sobrenadante sem perturbar o pellet. E ressuspenda as células em 10 mililitros de tampão de lavagem sem DNase. Transfira as células para um tubo de 15 mililitros e gire-as novamente, ressuspendendo o pellet em 100 microlitros de tampão de lavagem a frio.