Induzindo acidente vascular cerebral da substância branca em um modelo murino usando um inibidor de óxido nítrico

Comece com um camundongo anestesiado imobilizado em um quadro estereotáxico com um crânio exposto.

Marque o bregma e, em seguida, faça um furo, começando posteriormente no bregma e estendendo-se anteriormente, logo à esquerda da linha média.

Remova as camadas de tecido para expor o córtex cerebral rico em axônios mielinizados e aplique gotas salinas para evitar o ressecamento do tecido.

Conecte uma pipeta cheia de um inibidor de óxido nítrico a um braço injetor, que é posicionado em um ângulo para injeção precisa.

Ajuste as coordenadas estereotáxicas e injete o inibidor na substância branca do córtex cerebral, segurando a pipeta brevemente para evitar o refluxo.

Retraia e repita a injeção em outras coordenadas.

Posteriormente, feche o orifício e feche a incisão com adesivo.

Os inibidores se ligam a enzimas produtoras de óxido nítrico nas células endoteliais dos vasos sanguíneos, inibindo a produção de óxido nítrico e contraindo os vasos sanguíneos.

Essa constrição inibe o fluxo sanguíneo, levando a danos neuronais e formação de lesões, desenvolvendo um acidente vascular cerebral na substância branca.

Comece, primeiro fixando uma pipeta de vidro puxado em um tubo conectado a uma linha de vácuo. Insira a extremidade puxada na solução de L-Nio ou L-Nio mais marcador fluorescente. Inicie o vácuo e aplique a sucção até que pelo menos 2 milímetros da porção de 0,5 milímetros de diâmetro da pipeta estejam cheias.

Coloque a pipeta cheia de lado. Em seguida, coloque o mouse em um aparelho estereotáxico equipado com um microscópio estereotáxico. Depois de anestesiar e preparar o camundongo para a cirurgia de acordo com os procedimentos aprovados, verifique a profundidade da anestesia com um beliscão no dedo do pé. Não deve haver resposta.

Em seguida, ajuste o braço de injeção para 36 graus. Fixe um porta-pipetas de vidro puxado na extremidade distal de um sistema de injeção de baixa pressão de volume e fixe-o ao braço de injeção. Depois de fazer uma incisão no couro cabeludo na linha média de 1,5 centímetro para expor o crânio, seque a superfície do crânio com um cotonete.

Em seguida, enquanto olha através de um microscópio estereotáxico com ampliação de 1 a 3X, use uma ferramenta de microponto para remover qualquer tecido periosteal sobrejacente. Marque o bregma com um marcador de ponta fina e, em seguida, use uma broca cirúrgica equipada com uma broca cirúrgica de ponta fina para perfurar uma craniotomia elíptica de 2 milímetros, começando posteriormente no bregma e estendendo-se anteriormente à esquerda da linha média.

Remova fragmentos ósseos e tecidos moles sobrejacentes para que o córtex cerebral possa ser visualizado. Mantenha a superfície cortical úmida aplicando intermitentemente gotas de solução salina estéril. Em seguida, fixe a pipeta cheia no braço injetor. Alinhe a extremidade distal da pipeta com bregma e zere as coordenadas estereotáxicas.

Avance a pipeta para o primeiro ponto de injeção usando as coordenadas laterais anterior, posterior e medial listadas na tabela 1. Em seguida, avance a pipeta para a superfície cortical e zere a medida ventral dorsal. Abaixe lentamente a pipeta até a coordenada ventral dorsal.

Certifique-se de que a ampliação do microscópio estereotáxico esteja definida para 3X e que a retícula calibrada possa ser claramente viewed. View a pipeta inclinada de lado para que o menisco fluido de ar tenha uma visão sagital. O menisco deve aparecer no mesmo plano focal da parede interna e externa da pipeta.

Agora, usando um sistema de injeção de pressão de baixo volume, ajustado em 20 PSI para pulsos de 20 milissegundos, injete 100 nanolitros de L-Nio no cérebro. Depois de injetar o volume total, aguarde 5 minutos para evitar o refluxo no trajeto da pipeta. Em seguida, retire a pipeta e repita o procedimento de injeção no segundo e terceiro conjuntos de coordenadas fornecidos na tabela 1.

Após a injeção final, remova a pipeta e coloque cera óssea suficiente para preencher o local da craniotomia. Por fim, aproxime as bordas da ferida no couro cabeludo e prenda com adesivo dérmico.