Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neuroscience
0 visualizações • 2:37 min. • April 28th, 2025
Comece com uma seção espessa do cérebro que foi corada com solução de Golgi-Cox para escurecer seletivamente os neurônios e contracorada com violeta de cresil para destacar a região do cérebro.
Coloque-os em uma lâmina que foi pré-tratada com um agente de limpeza para aumentar a transparência do tecido.
Coloque a lâmina na platina do microscópio, aplique óleo de silicone e abaixe a lente objetiva até que ela entre em contato com o óleo.
O óleo de silicone corresponde ao índice de refração da lente objetiva e da lâmina, permitindo imagens detalhadas.
Foca na amostra e, em seguida, ajusta a exposição e o balanço de brancos da câmara para obter a melhor qualidade de imagem.
Foca na camada superior para definir o limite superior e, em seguida, na camada inferior para definir o limite inferior.
Ajuste o espaçamento entre imagens com sobreposição suficiente para captar detalhes de projeções neuronais.
Repita a imagem em locais diferentes para capturar áreas de interesse e, em seguida, sobreponha essas imagens para criar uma representação tridimensional dos neurônios.
Para capturar pilhas de imagens de alta resolução da área que contém o neurônio de interesse, primeiro selecione uma objetiva de imersão em óleo de silicone de 30x 1,05 NA no microscópio. Em seguida, aplique 3 a 4 gotas de óleo de imersão de silicone na lâmina. Coloque a objetiva sobre a corrediça, garantindo o contato entre a objetiva e o óleo. Foque a imagem e ajuste as definições da câmara, incluindo a exposição e o equilíbrio de brancos no software de imagem. Em seguida, defina os limites superior e inferior da pilha de imagens focalizando a parte superior da seção e selecionando Definir, ao lado da parte superior da pilha, na janela de aquisição de imagem.
Em seguida, concentre-se na parte inferior da seção e selecione Definir ao lado da parte inferior da pilha. Defina a distância do passo para 1 mícron inserindo 1 mícron ao lado da distância entre as imagens dentro da janela de aquisição de imagem. Por fim, capture a pilha de imagens selecionando adquirir pilha de imagens na janela de aquisição de imagens. Repita as etapas anteriores para capturar toda a área de interesse, certificando-se de que todas as pilhas de imagens se sobreponham em pelo menos 10% nos eixos x e y.