Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neuroscience
0 visualizações • 3:59 min. • August 7th, 2025
MOGtag é uma glicoproteína de oligodendrócitos de mielina recombinante fundida com etiquetas de solubilização e purificação para estudos experimentais de encefalomielite autoimune.
Para isolar o MOGtag, suspenda as células bacterianas que expressam MOGtag em um tampão de lise e incuba.
Enzimas e detergentes no tampão rompem os lipídios da membrana e degradam a parede celular.
Sonicar para lisar ainda mais as células, liberando corpos de inclusão insolúveis contendo MOGtag.
Centrifugue para peletizar os corpos de inclusão. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em tampão e incuba.
Adicione o cloridrato de guanidina e incube para solubilizar o MOGtag.
Transfira as proteínas solúveis para uma resina de níquel carregada, misture e incube agitando para permitir que o MOGtag se ligue aos íons de níquel.
Centrifugue para granular o MOGtag ligado. Remova o sobrenadante, ressuspenda o pellet em um tampão de eluição e incube com agitação.
O imidazol no tampão de eluição libera MOGtag da resina.
Centrifugue novamente, colete o sobrenadante contendo MOGtag purificado e armazene-o para análise posterior.
Distribua as culturas uniformemente entre frascos de 250 mililitros compatíveis com centrifugação de alta velocidade e mantenha os frascos no gelo a partir deste ponto. Pulverize as células bacterianas a 22.000 * g por 15 minutos a 4 graus Celsius. Ressuspenda e combine todos os pellets bacterianos em um total de 30 mililitros de tampão de lise. Transfira este volume para um tubo de fundo redondo de 50 mililitros capaz de centrifugação em alta velocidade.
Coloque este tubo em banho-maria a 30 graus Celsius por 30 minutos. Durante o tempo de incubação, agite o tubo duas vezes para ressuspender as células. Após a incubação, transferir o tubo para o gelo e sonicar a solução a 20 kilohertz e amplitude de 70%, pulsando durante três segundos e desligado durante três segundos durante 5 impulsos. Sonicar a solução durante seis voltas totais de cinco pulsos, permitindo que a solução arrefeça no gelo entre as voltas.
Em seguida, centrifugue a solução a 24.000 * g por 15 minutos a 4 graus Celsius, depois ressuspenda o pellet em 30 mililitros de tampão A e incube a solução a 4 graus Celsius por três horas. Em seguida, adicione 17,2 gramas de guanidina-HCl à solução. Incubar a amostra em gelo durante uma hora para solubilizar a proteína MOG tag. Para purificar a proteína MOG tag, transfira todo o volume de proteína solubilizada para o primeiro tubo contendo resina de níquel. Após a mistura, coloque o tubo horizontalmente em um balancim a 4 graus Celsius por uma hora.
Depois de centrifugar o tubo a 4.500 g por oito minutos a 4 graus Celsius, transferir o sobrenadante para o segundo tubo de resina de níquel e incubar como antes. Enquanto isso, ressuspenda a resina de níquel no primeiro tubo em 40 mililitros de tampão de eluição e coloque o tubo horizontalmente em um balancim a 4 graus Celsius por cinco minutos antes de centrifugar como antes. Transfira o sobrenadante contendo a proteína MOG tag eluída para um frasco de 250 mililitros rotulado com proteína MOG tag purificada. Mantenha esta garrafa a 4 graus Celsius.