Introdução à Microscopia de Fluorescência

Fluorescência é um fenômeno que ocorre quando uma substância absorve a luz em um determinado comprimento de onda e emite luz em outro comprimento de onda. A fluorescência ocorre como um elétron, que tem sido animado para um estado de energia mais alto e mais instável, relaxa para seu estado terrestre e emite um fóton de luz. A luz responsável pela excitação, ou mover o elétron para um estado de maior energia, é de comprimento de onda mais curto e maior energia do que a emissão de fluorescência, que tem um comprimento de onda mais longo, menor energia e cores diferentes.

A microscopia de fluorescência combina as propriedades de ampliação do microscópio leve com a tecnologia de fluorescência que permite a excitação e detecção de emissões de compostos químicos fluorescentes. Com a microscopia de fluorescência, os cientistas podem observar a localização de tipos celulares específicos dentro de tecidos ou moléculas dentro das células.

Os principais componentes do microscópio fluorescente se sobrepõem muito com o microscópio de luz tradicional. No entanto, as 2 principais diferenças são o tipo de fonte de luz e o uso dos elementos especializados do filtro.

A microscopia de fluorescência requer uma fonte de luz muito poderosa, como uma lâmpada de xenônio ou arco de mercúrio como a mostrada aqui. A luz emitida da lâmpada do arco de mercúrio é 10-100 vezes mais brilhante que a maioria das lâmpadas incandescentes e fornece luz em uma ampla gama de comprimentos de onda, do ultravioleta ao infravermelho. Esta fonte de luz de alta potência é a parte mais perigosa da configuração do microscópio de fluorescência, pois olhar diretamente para a luz não filtrada pode danificar seriamente suas retinas e manusear mal as lâmpadas pode fazê-las explodir.

O princípio por trás da microscopia de fluorescência é simples. À medida que a luz sai da lâmpada de arco, ela é direcionada através de um filtro mais excitante, que seleciona o comprimento de onda de excitação.

Esta luz é refletida em direção à amostra por um espelho especial chamado espelho dicrómico, que é projetado para refletir a luz apenas no comprimento de onda de excitação. A luz refletida passa pelo objetivo onde está focada no espécime fluorescente. As emissões do espécime, por sua vez, são passadas de volta através do objetivo – onde ocorre a ampliação da imagem – e agora através do espelho dicroico.

Esta luz é filtrada pelo filtro de barreira, que seleciona para o comprimento de onda de emissão e filtra a luz contaminante da lâmpada do arco ou outras fontes que são refletidas fora dos componentes do microscópio. Finalmente, a emissão fluorescente filtrada é enviada para um detector onde a imagem pode ser digitalizada, ou é transmitida para a ocular para visualização óptica.

O filtro exciter, o espelho dicroico e o filtro de barreira podem ser montados juntos em um componente conhecido como cubo de filtro. Diferentes cubos de filtro podem ser alterados durante a visualização da amostra para alterar o comprimento de onda de excitação, e uma série de diaframas podem ser usados para modificar a intensidade da excitação.

Quando se trata de realizar microscopia de fluorescência, o fluoróforo pode ser tão importante quanto o microscópio em si, e o tipo de fluoróforo que está sendo imageado dita o comprimento de onda de excitação usado e o comprimento de onda de emissão detectado. Os comprimentos de onda de excitação contêm uma pequena gama de energias que podem ser absorvidas pelo fluoróforo e fazem com que ela transite para um estado animado. Uma vez animado, uma ampla gama de emissões, ou transições de volta para o estado de menor energia, são possíveis resultando em um espectro de emissões.

A diferença entre o pico da curva de absorção, ou excitação e o pico da curva de emissão é conhecida como Mudança de Stoke. Quanto maior a distância neste turno, mais fácil é separar os dois comprimentos de onda diferentes. Além disso, qualquer espectro sobreposto precisa ser removido pelos componentes do cubo do filtro para redução de fundo e melhor qualidade de imagem.

A exposição do fluoróforo à excitação prolongada fará com que ele fotobleach, que é um enfraquecimento ou perda de fluorescência. Para reduzir o fotobleaching, você pode adicionar um meio de montagem anti-fade ao slide e selar as bordas com esmalte. O slide também deve ser mantido no escuro quando não for imageado.

Para começar a imagem de fluorescência, ligue a fonte de luz de xenônio ou mercúrio e deixe-a aquecer por até 15 minutos para que ela atinja a iluminação constante.

Em seguida, coloque sua amostra no palco e fixe-a no lugar. Em seguida, ligue a fonte de luz branca do seu microscópio. Concentre-se na sua amostra usando o objetivo mais baixo, ajustando os botões de foco grosseiro e fino. Em seguida, use os botões de ajuste de estágio para encontrar sua área de interesse.

Em seguida, desligue a fonte de luz branca, bem como quaisquer luzes desnecessárias para reduzir o fundo.

Selecione o cubo de filtro correto para o corante que você está que está abrindo o obturador para iluminar sua amostra.

Por fim, faça ajustes finos de foco e direcione a luz de saída para a câmera de imagem. Você provavelmente precisará fazer ajustes no tempo de exposição para cada fluorohore diferente ou corante fluorescente usado. No entanto, é importante manter o tempo de exposição constante ao comparar características com o mesmo corante em diferentes amostras.

Para imaginar vários corantes na mesma amostra, altere o cubo do filtro para combinar com cada fluoróforo e registre a nova imagem.

Depois que cada corante da amostra foi imageado, imagens individuais podem ser sobrepostas e mescladas.

Muitos tipos diferentes de experimentos podem fazer uso de microscopia fluorescente e envolver diferentes tipos de fluoroforos Uma das aplicações mais comuns da microscopia fluorescente é a imagem de proteínas que foram rotuladas com anticorpos que estão ligados, ou "conjugados" a compostos fluorescentes.. Aqui, um anticorpo em direção às proteínas da superfície leptospiral foi detectado usando um anticorpo secundário conjugado ao alexafluor-488, que fluoresce verde quando animado.

Outra forma de destacar uma característica específica com fluorescência é integrar o código para uma proteína fluorescente como proteína fluorescente verde, ou GFP, no DNA de um organismo. O gene para GFP foi originalmente isolado de águas-vivas e pode ser expresso, ou produzido, por células cultivadas em resposta a gatilhos específicos ou como parte de um tipo específico de célula como as células tumorais mostradas brilhando nesta imagem

Outra aplicação da imagem de fluorescência é a Fluorescence Speckle Microscopy, que é uma tecnologia que usa conjuntos macromoleculares fluorescentes rotulados, como a rede F-actin vista aqui, para estudar o movimento e a cinética de rotatividade desta importante proteína citoesquelética.

Uma técnica avançada conhecida como recuperação da fluorescência após fotobleaching, ou FRAP, é realizada por fotobleaching intencionalmente uma pequena região de uma amostra, a fim de monitorar a taxa de difusão de moléculas fluorescentes rotuladas de volta para a região fotobleachada.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à Microscopia de Fluorescência.

Neste vídeo aprendemos sobre o conceito de fluorescência, como a microscopia de fluorescência difere da microscopia leve e como tirar uma imagem de fluorescência através do escopo. Também aprendemos sobre algumas aplicações básicas e avançadas que usam fluorescência. Obrigado por assistir e não se esqueça enquanto fotobleaching fica ótimo em seus dentes não é tão bom para suas amostras.