Name: Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda a rastrear células GFP em embriões de peixe-zebra transgênicos usando o sistema fotoconversível PSmOrange. Este método permite estudar origens celulares durante o desenvolvimento embrionário e doenças.

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Agradecemos a O. Subach por fornecer o plasmídeo H2B-PSmOrange original e nossa equipe de instalações de peixes para o cuidado dos peixes. Somos gratos ao Nikon Imaging Center da Universidade de Heidelberg pelo acesso ao equipamento de microscopia e software de análise. Reconhecemos o apoio do Core Facility Live Cell Imaging Mannheim no CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). Este trabalho foi apoiado pelo Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Coordenação espaço-temporal de processos de sinalização (EcTop 2), Universidade de Heidelberg para C.A.B. e a Faculdade de Medicina de Mannheim da Universidade de Heidelberg e a DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 e 298/6-1) para M.C.

1. H2B-PSmOrange mRNA transcrição in vitro e mRNA Purificação <ol><li> Linearizar o H2B-PSmOrange contendo pCS2 + plasmídeo utilizando a enzima de restrição NotI de acordo com as instruções do fabricante. Nota: Execute as seguintes etapas usando proteções adequadas, tais como luvas e bata de laboratório para evitar a contaminação e degradação do mRNA. </li><li> Purifica-se o ADN linearizado utilizando um kit de purificação ou de fenol-clorofórmio PCR métodos baseados acordo com os protocolos dos fabricantes. </li><li> Use 1 ug de ADN molde linearizados para transcrição sp6-ARNm de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Remover o DNA pela adição de 1,0 U de RNase livre ADNasel durante 10-20 min a 37 ° C. </li><li> Limpar o mRNA usando um RNA limpar kit de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Para aumentar a pureza e concentração de ARNm, o ARNm de precipitar por adição de 6 ul de acetato de sódio (3,0 M, pH 5,2) e 150 ul de etanol a 96%. Incubar a mixed solução a -20 ° C durante pelo menos 30 minutos e até 24 h. </li><li> Recolhe-se o ARNm por fiação da solução a 18,407 xg durante 45 min a 4 ° C. Descartar o líquido e ressuspender o ARNm em 150 ul de etanol a 70%. Misturar e centrifugar a solução durante mais 15 min a 4 ° C. Descartar o líquido, secar o sedimento durante 5 minutos em gelo e ressuspender o ARNm em 20 ul de ARNase ultrapura água livre. </li><li> Avaliar a concentração e pureza do ARNm por medição fotométrica de uma diluição 1: 100 de ARNm (ARNm 1 ul em 99 ul ultrapura RNase isenta de água). </li><li> Para armazenagem a curto prazo, manter a solução de ARNm a -20 ° C. Para armazenamento a longo prazo, manter o ARNm a -80 ° C. </li></ol> 2. H2B-PSmOrange mRNA microinjeção em embriões Zebrafish <ol><li> Configurar o acasalamento pares na noite antes da injeção usando tg (FOXD3: GFP); tg (FLH: GFP) peixes transgénicos casal (ou qualquer outro peixe transgénico GFP). Deixar o peixe separada por colocação de um espaçadorentre eles para controlar o tempo de acasalamento. </li><li> Remova o espaçador na manhã de injecção e deixar o companheiro de peixe para 20 min. </li><li> Durante o acasalamento tempo, dilui-se o ARNm H2B-PSmOrange até à concentração final de 130 pg / NL (em RNase isenta de água) e a transferência de 6 ul de solução de injecção para um capilar de microinjecção utilizando uma ponta de microloader. Verifique o volume de injeção com uma lâmina de vidro calibrado. Ajuste a pressão de injeção para injetar 2 solução mRNA nl (260 pg). </li><li> Recolher os ovos em uma placa de petri de plástico esterilizado contendo Embryo 1x médio (E3). </li><li> Transferir 20 a 30 embriões de um prato de injecção, utilizando uma pipeta de pasteur de plástico. </li><li> Injectar 2 nl de ARNm contendo uma solução para a célula ou apenas abaixo da célula na gema no estádio de uma célula-11. </li><li> Transferência de embriões injetado em uma-placa de petri contendo meio 1x E3, retire os embriões que se desenvolveram normalmente não fertilizados ou não e cultivá-las a 28 ° C. Nota: A proteção Luz of os embriões não é necessário durante todo o experimento. </li><li> Elevar embriões de peixe-zebra em meio 1x E3 e adicionar PTU 0,2 mM (1-fenil-2 tioureia) após a gastrulação para inibir a pigmentação. Mudar o meio duas vezes por dia para minimizar o perigo de contaminações bacterianas. </li></ol> 3. Embryo Embedding <ol><li> Seleccione a GFP (verde) e PSmOrange (laranja / vermelho) embriões co-expressando usando um microscópio binocular equipado com uma lâmpada fluorescente e filtros de emissão adequados. Transferir os embriões positivos em uma placa de petri estéril contendo meio 1x E3. </li><li> Embriões Dechorionate sob um microscópio estereoscópico com a pinça 12. </li><li> Transferência de um embrião em um tubo de 1,5 ml contendo 1,0 ml de pré-aquecido 1,0% de agarose de baixa fusão (LMA) preparadas em água ultrapura, utilizando uma pipeta de corte de ponta (P200). Nota: Aquecer o LMA a 80 ° C e arrefecer durante 3-5 minutos à temperatura ambiente antes de incorporar o embrião. </li><li> Transferir o embrião em 150 ul LMA numacompartimentado lamela e ajustar a orientação do embrião, por exemplo, o lado dorsal para baixo na experiência descrita para o laser confocal de varredura microscópio invertido A1R + (ou qualquer outro microscópio adequado), utilizando uma ponta de plástico fino. Quando o LMA é polimerizado, encher a câmara com água de peixe contendo PTU 0,2 mM e 0,02% de acetato de 3-aminobenzoato metanossulfonato (tricaina) para a anestesia. </li><li> Antes de imagem da amostra, esperar 15 min para determinar o efeito de tricaina. A anestesia impede movimentos embrião, que pode ser monitorado usando um estereomicroscópio equipado com iluminação de campo claro. Nota: As câmaras podem ser reutilizado duas vezes. </li></ol> 4. PSmOrange fotoconversão <ol><li> Colocar a amostra sob o microscópio confocal e digitalizar a amostra para identificar a área para photoconvert usando 488 nm e 561 nm lasers para geração de imagens GFP e PSmOrange respectivamente. Nota: Use o confocal de varredura a laser do microscópio invertido A1R + no sta invertidoge TiEcontrolled pelo software de imagem de microscópio e equipado com 488 nm, 561 nm e 640 nm lasers para fotoconversão e imagem. No entanto, a aplicação, certamente, não está restringido a esta microscópio, enquanto as linhas de laser para a conversão e de imagem estão disponíveis. <ol><li> Coloque o objectivo de ar 20X no lugar (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm). </li><li> Use as seguintes configurações microscópio para detectar a proteína PSmOrange antes fotoconversão: 561 nm laser, 0,74 mW medido no plano de foco acima do objetivo. Nota: Isto corresponde a 40% neste sistema (de medida no plano do foco é a única forma de determinar a potência efectiva). Ajustar a potência de laser de acordo com as necessidades experimentais como a eficiência de injecções H2B-PSmOrange pode variar. </li><li> Adicionar fatores de zoom para destacar a área de interesse. ampliações reduzir o tempo de aquisição de imagem e, portanto, fototoxicidade. </li></ol></li><li> Adquirir uma z-stack que cubra a estruturas de interesse utilizando 488 nm e 561 nm lasers no modo sequencial (modo de linha 1-&gt; 4). Fixar o z-passo entre 1,0 e 2,0 mm. média linha ea frequência de scaneamento pode ser usado para otimizar a qualidade da imagem. </li><li> Digitalizar a amostra e selecione a região de interesse ferramenta (ROI) para realçar a área para photoconvert. Fixar o ROI como área de estimulação. Selecione o módulo Foto Activation / Branqueamento, ativar o laser de 488 nm, marcando a respectiva caixa de e definir o laser de 488 nm a 80% (potência do laser 1 mW medida no objetivo). Defina a velocidade de digitalização para 0,5 seg / Frame. </li><li> Abra o utilitário fotoconversão (ND Stimulation) e especifique as configurações fotoconversão. <ol><li> Clique no comando &quot;Adicionar&quot; para especificar o protocolo de fotoconversão. </li><li> Ajuste &quot;Fase&quot; 1 no menu &quot;Aquisição / Estimulação&quot; a &quot;Aquisição&quot; e indicar o número de imagens a serem adquiridos antes fotoconversão no menu &quot;Loops&quot;. </li><li> Ajuste &quot;Fase&quot; 2 para &quot;Stimulation &quot;e digite o número de eventos de estimulação a ser realizada. </li><li> Ajuste &quot;Fase&quot; 3 como descrito para &quot;Fase&quot; 1. Opcionalmente, insira uma espera &quot;Phase&quot; depois de &quot;Phase&quot; 2 digitando o tempo de espera antes da última rodada de aquisição de imagem. </li><li> Uma vez que todos os parâmetros são definidos, aplicar a definição estimulação e executar o fotoconversão. Nota: A potência do laser, a frequência de digitalização e número de iterações para cada rodada de fotoconversão pode variar e ser diferente de embrião para embrião. Uma configuração para começar com é mostrado na Tabela 1. </li></ol></li><li> Adquirir uma z-stack final usando 488 nm, 561 nm e 640 nm lasers de aplicar as configurações como acima. Definir o laser de 640 nm para visualizar a PSmOrange convertido utilizando alta potência do laser (até 4,5 mW). </li></ol> 5. Desmontar Embrião de LMA <ol><li> Remover o embrião contendo câmara do microscópio. Remova cuidadosamente o embrião do u agarosecantar fórceps. </li><li> Transferência do embrião para um novo plástico esterilizado placa de petri ou em um de 6 poços de placa esterilizada contendo 1x E3 e UTP 0,2 mM. Incubar o embrião a 28 ° C até à fase de desenvolvimento desejado. </li></ol> 6. Analisando o Fate of Photoconverted PSmOrange proteína células que expressam <ol><li> Re-inserir o embrião como descrito nos pontos 3.3 e 3.4. </li><li> Colocar a amostra sob o microscópio confocal e digitalizar a amostra para identificar as células photoconverted (640 nm) na estrutura transgênica GFP de interesse (488 nm). </li><li> Adquirir uma z-stack cobrindo as estruturas de interesse utilizando 488 nm, 561 nm e 640 nm lasers no modo sequencial (modo de linha 1-&gt; 4). Fixar o z-passo entre 1,0 e 2,0 mm. média linha ea frequência de scaneamento pode ser usado para otimizar a qualidade da imagem. </li><li> Use um dos seguintes métodos para identificar células, que GFP co-express e a proteína photoconverted. <ol><li> personalizado feito Imagem automática FijiJ 3 Macro <ol><li> Convolve a pilha original usando o plugin &quot;GaussianBlur&quot; (→ Processo → Filtros → GaussianBlur) e subtrair as pilhas lisas do original usando o plugin &quot;Calculadora de Imagens&quot; (→ Processo → Calculadora de Imagem). Usar este passo de visualizar as estruturas de interesse e reduzir o tempo de processamento para a análise. </li><li> Aplicar limites específicos para os canais verde e vermelho-distante, a fim de destacar as células photoconverted (→ Imagem → Ajuste → Threshold). Use o &quot;Analisar Particles&quot; ferramenta para detectar as áreas de limiar com um ambiente adequado (→ Analisar → Analisar Partículas). </li><li> Abra o plugin &quot;Calculadora Imagem&quot; e exibir os ROIs sobrepostos no canal verde e vermelho-distante em amarelo (→ Processo → Calculadora de Imagem). </li></ol></li><li> software de imagem de microscópio para avaliação de dados 3D <ol><li> Mostrar a pilha no3D utilizando a opção view show de volume (→ 3D Menu de visualização → Mostrar Volume View). Use a interface gráfica para selecionar os canais verde, vermelho e far-vermelhos, ajustar o brilho eo contraste e recortar a pilha 3D para destacar a área photoconverted (Figura 1). Nota: métodos similares para analisar os dados estão disponíveis na maior parte do software comum para análise de imagem. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (4350), (2012).</li>
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<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), e1115(2009).</li>
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<li>Concha, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+tissue+interactions+across+the+dorsal+midline+of+the+forebrain+establish+CNS+laterality%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality.</a> Neuron. 39, 423-438 (2003).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+conversion+of+eGFP-+into+Gal4-transgenic+lines+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish.</a> Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Research. 24, 142-153 (2014).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

embriões transgénicos portadores de repórteres fluorescentes têm ajudado fundamentalmente para entender o desenvolvimento embrionário. No entanto, existe ainda a necessidade essencial de promotores de facilitar a visualização específica de estruturas particulares. Na sua ausência, os pesquisadores dependem de técnicas como a fotoconversão de proteínas fluorescentes para saber mais sobre a origem eo desenvolvimento de sua estrutura de interesse. Esta por sua vez é um pré-requisito fundamental para identificar os mecanism...

Melhorar exponencialmente as técnicas de imagem permite acompanhar os processos de desenvolvimento ao longo de períodos de tempo de até cerca de quatro dias consecutivos3. No peixe-zebra e em muitos outros sistemas de modelos animais, células, tecidos, estruturas axonais ou vasculares específicas são marcadas por proteínas fluorescentes transgênicas verdes ou às vezes vermelhas ou amarelas para facilitar a visualização. No entanto, na maioria das linhagens transgênicas, o transgene não é expresso especificamente nas células de interesse, mas também em estruturas adicionais, o que dificulta o rastreamento preciso de, por exemplo, células individuais ou grupos de células.
As proteínas fotoconversíveis fluorescentes são adequadas para o rastreamento celular durante o desenvolvimento embrionário. Os pré-requisitos para a aplicação de tais proteínas são uma natureza de longa duração, uma faixa de emissão bem separada após a conversão e fluorescência brilhante. As proteínas fotoconversíveis disponíveis compreendem aquelas que mudam sua faixa de emissão após a conversão, como Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 ou Dendra27 e outras que são apenas fluorescentes quando fotoativadas (PAmCherry8, PAGFP9 ou PATagRFP10). Suas aplicações para rastrear células em animais transgênicos FP existentes são, no entanto, limitadas, pois geralmente envolvem um estado fluorescente verde ou não atendem a todos os critérios acima. Apenas recentemente, Subach e colegas relataram a proteína PSmOrange, que muda sua emissão de laranja / vermelho para vermelho distante após a fotoconversão e foi aplicada com sucesso em células em cultura e células cultivadas injetadas em camundongos2.
Para investigar a adequação da proteína para rastreamento celular em um embrião vivo, geramos uma construção de expressão para a microinjeção de H2B-PSmOrange marcado com energia nuclear em embriões de peixe-zebra. Descobrimos que a proteína preenche todos os pré-requisitos para o rastreamento celular bem-sucedido em fundos transgênicos GFP durante os primeiros 4 (e possivelmente mais) dias de desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Durante esse período, a maioria dos eventos migratórios celulares é concluída em peixes, tornando o sistema PSmOrange um excelente complemento para o kit de ferramentas do peixe-zebra.

<table><tbody><tr><td>Kit de Purificação PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de Transcrição</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniElute Kit de limpeza</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur</td><td>alpha laboratories</td><td>LW4000</td><td></td></tr><tr><td>Original H2B-PSmOrange Plasmid</td><td>Addgene</td><td>31920</td><td>O plasmídeo descrito no artigo é disponível no laboratório Carl</td></tr><tr><td>Microinjetor FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.013</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps (5 Inox)</td><td>NeoLab</td><td>2-1633</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Chambered #1.5 Sistema de Cobertura de Vidro Alemão&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R+</td><td>Nikon GmbH Alemanha</td><td>Sem Número</td><td></td></tr><tr><td>Nikon PLAN Apo &lambda; Objetiva de ar 20X&nbsp;</td><td>Nikon GmbH Alemanha</td><td>Sem Número</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Software AR (v. 4.30.02)</td><td>Nikon GmbH Alemanha/Imagens de Laboratório</td><td>Sem Número</td><td></td></tr></tbody></table>

acompanhando as células gfp em peixes-zebra transgénicos usando o sistema photoconvertible psmorange

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

O rápido desenvolvimento de embriões transparentes de peixe-zebra (Danio rerio) em combinação com marcações fluorescentes de células e tecidos permite visualizar os processos de desenvolvimento à medida que acontecem no animal vivo. As células de interesse podem ser marcadas usando um promotor específico do tecido para conduzir a expressão de uma proteína fluorescente (FP) para a geração de linhagens transgênicas. O uso de proteínas fotoconversíveis fluorescentes para esse fim também permite seguir com precisão estruturas definidas dentro do domínio de expressão. Iluminar a proteína na região de interesse, altera seu espectro de emissão e destaca uma determinada célula ou aglomerado de células, deixando outras células transgênicas em sua cor original. Uma grande limitação é a falta de promotores conhecidos para um grande número de tecidos no peixe-zebra. Por outro lado, as telas de armadilhas de genes e intensificadores geraram enormes recursos transgênicos, rotulando discretamente literalmente todas as estruturas embrionárias, principalmente com GFP ou, em menor extensão, FPs vermelhos ou amarelos. Uma abordagem para seguir estruturas definidas em tais fundos transgênicos seria introduzir adicionalmente uma proteína fotoconversível onipresente, que poderia ser convertida na(s) célula(s) de interesse. No entanto, as proteínas fotoconversíveis disponíveis envolvem um estado de emissão verde e / ou menos frequentemente vermelho1 e, portanto, muitas vezes não podem ser usadas para rastrear células no fundo FP de linhagens transgênicas existentes. Para contornar esse problema, estabelecemos o sistema PSmOrange para o peixe-zebra2,3. A simples microinjeção de mRNA sintético que codifica uma forma nuclear desta proteína marca todos os núcleos celulares com fluorescência laranja / vermelha. Após a fotoconversão direcionada da proteína, ela muda seu espectro de emissão para vermelho distante. A eficiência quântica e a estabilidade da proteína tornam o PSmOrange uma excelente ferramenta de rastreamento de células para peixes-zebra e possivelmente outras espécies de teleósteos.

A Figura 1 ilustra um exemplo do sistema PSmOrange fotoconversão. O complexo pineal é uma estrutura conservada no diencéfalo dorsal vertebrado. Como em muitos outros vertebrados, esse complexo é constituído por o órgão pineal no centro do diencéfalo e as células parapineal do lado esquerdo. Experimentos uncaging elegantes, mas demoradas mostraram que as células parapineal originam na parte anterior do órgão pineal 13. Em tg (FOXD3: GFP); tg (FLH: GFP) embriões...

Estabelecemos o sistema PSmOrange fotoconversível como uma ferramenta poderosa, direta e barata para rastreamento de células in vivo em fundos transgênicos GFP. Este protocolo descreve sua aplicação no sistema modelo de peixe-zebra.

Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

O objetivo geral da Tecnologia de Conversão Fotoativa PSmOrange é acompanhar células em animais vivos durante o desenvolvimento embrionário e em condições de doença. Este método pode responder perguntas fundamentais na biologia do desenvolvimento, como revelar a origem de células que se diferenciam em tecidos e órgãos. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser aplicada em linhagens transgênicas para GFP.Este método também pode ser aplicado em diferentes áreas de investigação, como regeneração, progressão e invasão tumoral. Após gerar e incorporar embriões expressando PSmOrange e GFP conforme o protocolo descrito, posicione o embrião sob o microscópio confocal e utilize a objetiva de ar 20x e os lasers de 488 e 561 nanômetros para escanear o espécime e identificar uma área para fotoconversão. Para detectar a proteína PSmOrange antes da fotoconversão, use o laser de 561 nanômetros com potência de 0,74 miliwatts medida no plano de foco acima da objetiva e ajuste a potência do laser conforme necessário.Ajuste os fatores de zoom para destacar a área de interesse e reduzir o tempo de aquisição de imagem e a fototoxicidade. Usando os lasers de 488 e 561 nanômetros em modo sequencial e um passo Z entre 1,0 e 2,0 micrômetros, adquira uma pilha Z que cubra as estruturas de interesse. Ajuste a média de linha e a frequência de varredura para otimizar a qualidade da imagem.Em seguida, escaneie a amostra e selecione a região de interesse, ou ferramenta ROI, para destacar a área a ser fotoconvertida antes de fixar a ROI como área de estimulação. Selecione o módulo de fotobranqueamento por fotoativação, marque a caixa para ativar o laser de 488 nanômetros, depois configure o laser de 488 nanômetros em 80% e a velocidade de escaneamento em 0,5 segundos por quadro. Em seguida, abra o utilitário de fotoconversão e clique em Adicionar para especificar o protocolo de fotoconversão.No menu de estímulo de aquisição, defina a Fase Um como aquisição e, no menu de ciclos, indique o número de imagens a serem adquiridas antes da fotoconversão. Defina a Fase Dois como estímulo e insira o número de eventos de estímulo a serem realizados. Ajuste a Fase Três conforme descrito para a Fase Um.Opcionalmente, insira uma Fase de Espera após a Fase Dois inserindo o tempo de espera antes da última rodada de aquisição de imagens. Uma vez definidos os parâmetros, aplique a configuração de estimulação e execute a fotoconversão. As configurações microscópicas são cruciais para a fotoconversão de PSmOrange.Para garantir uma fotoconversão bem-sucedida, o embrião é visualizado imediatamente após o experimento para detectar a proteína PSmOrange fotoconvertida. Se a conversão não foi bem-sucedida, o procedimento é repetido. Utilizando os lasers de 488, 561 e 640 nanômetros e ajustando o laser de 640 nanômetros para alta potência, até 4,5 miliwatts, adquira uma pilha z final com as configurações acima descritas.Para desmontar o embrião, remova a câmara do microscópio e use pinças para retirar o embrião do agarose. Transfira o embrião para um novo recipiente plástico esterilizado, ou placa de 6 poços esterilizada, contendo PTU 0,2 milimolar em E3. Incube o embrião a 28 graus Celsius até o estágio desejado de desenvolvimento. Para analisar o destino das células expressando a proteína fotoconvertida PSmOrange, reembeba o embrião de acordo com o protocolo descrito no texto.Sob o microscópio confocal, examine a amostra para identificar células fotocovertidas na estrutura transgênica de interesse marcada com GFP. Utilize os lasers de 488, 561 e 640 nanômetros para adquirir uma pilha z com um intervalo fixo de 1 a 2 micrômetros em modo sequencial, cobrindo as estruturas. Com o software Image J Fiji, identifique células que coexpressam GFP e a proteína fotocovertida.Duplique a pilha original, utilize o plugin Gaussian Blur e a calculadora de imagens para subtrair as pilhas suavizadas da original. Aplique limiares específicos aos canais verde e vermelho distante para destacar as células fotoconvertidas. Em seguida, utilize a ferramenta Analyze Particles para detectar as áreas com limiar no canal verde com uma configuração adequada.Repita este passo para o canal vermelho distante. Abra o plugin calculadora de imagem para detectar as células com co-localização. Exiba em amarelo as ROI sobrepostas no canal verde ou no canal vermelho distante utilizando a ferramenta Analisar Partículas.Utilizando o software NIS-Elements, realize a avaliação de dados tridimensionais e exiba a pilha em 3D com a opção Mostrar Visualização de Volume. Em seguida, use a interface gráfica para selecionar os canais verde, vermelho e vermelho distante, ajuste o brilho e o contraste e recorte a pilha tridimensional para destacar a área fotoconvertida. É mostrado aqui um exemplo do sistema de fotoconversão PSmOrange em embriões transgênicos de peixe-zebra FOXD3 com cabeça flutuante GFP.Em 26 horas pós-fertilização, dois aglomerados celulares na região anterior da pineal foram fotoconvertidos e imediatamente analisados. A proteína foi detectada com um laser vermelho distante de 640 nanômetros, mas não com um laser de 561 nanômetros. Nessas células, a expressão de GFP foi inicialmente reduzida devido ao clareamento fotônico.Em 52 hpf, GFP e H2B PSmOrange foram detectados nas células expressoras da proteína H2B PSmOrange fotoconvertida. Algumas dessas células formaram o parapineal no lado esquerdo do cérebro. Esse resultado é consistente com relatos anteriores sobre a origem das células do parapineal na pineal anterior e demonstra a aplicabilidade da técnica PSmOrange em embriões vertebrados transgênicos vivos para GFP.Após este procedimento, a análise de rastreamento celular pode ser realizada em embriões geneticamente manipulados para responder questões adicionais sobre as hierarquias moleculares que subjazem ao desenvolvimento celular.

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