Uma visão geral da engenharia genética

Engenharia genética é a alteração proposital do DNA de um organismo. Os avanços neste campo permitiram que os cientistas gerassem células e organismos geneticamente modificados para pesquisas biomédicas e fins agrícolas. No entanto, a aplicação de tecnologias genéticas para uso como terapêutica em humanos, conhecida como terapia genética, ainda é um trabalho em andamento.

Neste vídeo, discutiremos algumas descobertas importantes na história da engenharia genética, grandes questões que estão sendo estudadas hoje, importantes ferramentas para alterar o genoma de um organismo e várias aplicações dessas tecnologias.

Vamos começar revendo a história da engenharia genética.

A capacidade dos cientistas de manipular diretamente genes dependia de resolver a identidade do material genético. Em 1928, Frederick Griffith observou que injetar uma mistura de bactérias virulentas mortas pelo calor e uma cepa viva, mas não virulenta, em camundongos resultou em doenças, levando-o a uma hipótese de um "princípio transformador" que se transferiu dos mortos para bactérias vivas.

Em 1944, Oswald Avery, Colin Macleod e Maclyn McCarty identificaram o DNA da bactéria como responsável por essa transformação. O resultado foi validado ainda em 1952, quando Alfred Hershey e Martha Chase usaram bacteriófagos radioativos para mostrar que é o DNA do vírus, e não proteína, que foi transmitido durante sua infecção por células bacterianas.

Também em 1952, Joshua Lederberg hipóteseva a existência de plasmídeos — pequenos pedaços circulares de DNA que podem ser transmitidos entre bactérias. Na mesma época, ele também descreveu a transdução, onde os vírus agem como vetores para transmitir DNA entre as células.

A partir de 1970, pesquisadores como Hamilton Smith começaram a descobrir algumas das "ferramentas" práticas da engenharia genética, como a restrição de endonucleases, que "cortam" o DNA em sequências específicas. Usando essas ferramentas, em 1972, Paul Berg gerou a primeira molécula de DNA "recombinante" unindo DNA de dois vírus diferentes, e em paralelo, Stanley Cohen e Herbert Boyer geraram o primeiro organismo recombinante colocando um gene de resistência a antibióticos em um plasmídeo e transformando essa construção na bactéria E. coli.

Em 1973, Rudolf Jaenisch criou o primeiro organismo multicelular transgênico, um rato contendo DNA viral SV40, embora não tenha sido até 1981, quando vários outros laboratórios criaram os primeiros camundongos transgênicos capazes de passar os genes inseridos para seus descendentes. Em meados da década de 1980, Mario Capecchi e Oliver Smithies estabeleceram pela primeira vez que a recombinação homóloga poderia ser usada para atingir especificamente genes, e em 1989 usou esse método para gerar o primeiro rato nocaute, onde um gene é tornado não funcional.

Em seguida, vamos examinar algumas questões-chave na engenharia genética.

Uma área integral da pesquisa é determinar o melhor método para modificar o genoma de um organismo. Uma série de fatores precisam ser considerados, incluindo a eficiência do processo de modificação, bem como se a modificação precisa ser direcionada a genes específicos para minimizar riscos de alterações não intencionais no DNA celular.

Para modificar o genoma de uma célula hospedeira, a sequência de DNA artificialmente montada para fazer essa modificação, conhecida como "construção genética", deve ser entregue com sucesso naquela célula. A pesquisa nessa área visa maximizar a eficiência ao mesmo tempo em que limita a citotoxicidade. No nível do organismo, os pesquisadores estudam como modificar vetores como partículas retrovirais ou nanopartículas para melhorar a entrega de construções para populações de células-alvo.

Finalmente, há muito interesse em saber se a engenharia genética pode ser aplicada com sucesso a usos agrícolas ou terapêuticos. Essas tecnologias têm sido usadas para gerar poderosas ferramentas de pesquisa, como camundongos com genes excluídos ou "nocauteados", ou para inserir traços simples e únicos, como a resistência a herbicidas nas culturas. No entanto, problemas complexos, como a geração de culturas que prosperam em condições adversas, provavelmente exigirão modificar múltiplas vias simultaneamente. Além disso, desenvolver terapias genéticas para tratar doenças genéticas, necessitando de uma entrega segura e eficaz de construções genéticas às células humanas, continua sendo uma tarefa desafiadora.

Vamos agora dar uma olhada nas ferramentas de engenharia genética e tecnologias usadas pelos pesquisadores.

O método clássico para gerar construções genéticas é a clonagem baseada em enzimas de restrição, onde peças de DNA são digeridas e depois recombinadas em ordem específica usando ligases de DNA para criar um novo plasmídeo. Técnicas mais novas incluem recombineamento, que usa recombinação homóloga para isolar e trocar fragmentos de DNA sem a necessidade de restrições de locais de digestão enzimápica.

O DNA pode ser entregue nas células por vários métodos. Transformação ou transfecção é o processo de colocar DNA nu em células bacterianas ou eucarióticas, respectivamente. As alcaações divalentas, como o cálcio, podem tornar as membranas celulares mais porosas, o que aumentará a absorção de moléculas de DNA exógenos. A eletroporação usa um campo elétrico para realizar a mesma tarefa, enquanto as nanopartículas lipídicas que cercam o DNA podem se fundir com a membrana celular e liberar sua carga. Transdução refere-se à transferência de DNA por um vetor viral, como um lentivírus.

Entregar construções genéticas em organismos multicelulares requer considerações adicionais. Quando vários tipos de células estão presentes, vetores direcionados, como vírus ou nanopartículas, aumentam a especificidade da entrega celular. Nas plantas, pesquisadores cooptaram o agrobacterium, um patógeno vegetal capaz de transferir DNA para células vegetais, como ferramenta de entrega de genes. "Biolística" refere-se ao uso de uma "arma genética" para entregar contas de ouro revestidas de DNA nas células.

Finalmente, os construtos de DNA entregues precisam fazer mudanças permanentes no genoma do hospedeiro, a fim de alcançar efeitos a longo prazo. Isso pode ocorrer por integração aleatória da construção de DNA entregue no DNA hospedeiro, que pode ser aprimorada marcando a construção com locais de reconhecimento para enzimas de DNA "corte e cola" chamadas transposases. Por outro lado, técnicas como segmentação genética via recombinação homólogoa permitem a integração em locais genômicos específicos. Os recentes avanços em técnicas conhecidas como edição de genomas, que usam núcleos personalizados para gerar quebras de dois fios em loci específicos, melhoram muito a eficiência do alvo genético.

Agora, vamos dar uma olhada em como as tecnologias de engenharia genética estão sendo aplicadas hoje.

Funções celulares em eucariotes são compartimentalizadas em organelas, e direcionar a expressão de proteína transgênica para compartimentos individuais pode permitir efeitos biológicos mais específicos. Neste experimento, os pesquisadores geraram uma construção de repórter com etiqueta GFP usando a técnica de montagem gibson, onde regiões homólogos de sobreposição entre múltiplos produtos PCR permitem a geração de uma construção completa sem o uso de enzimas de restrição. A transfecção biolística foi usada para entregar esses construtos em células vegetais, e os pesquisadores foram capazes de demonstrar a expressão GFP direcionada ao cloroplasto.

Células cancerígenas muitas vezes expressam receptores super-expressais da superfície, que os pesquisadores podem direcionar usando terapia genética. Aqui, os cientistas estabeleceram um modelo de câncer de bexiga humana em camundongos. Isso é seguido pela entrega tópica de um vetor adenoviral para as células cancerígenas da bexiga. A observação da expressão da luciferase nas células cancerosas indicou o sucesso da entrega do gene repórter.

Finalmente, estão sendo feitos progressos na engenharia de caminhos biológicos completos em um organismo alvo. Aqui, cada gene da via biossintética para o antibiótico eritromicina foi isolado de suas bactérias hospedeiras, Saccharopolyspora erythraea, via PCR e combinado em construções semelhantes a operon onde uma série de genes são colocados sob controle pelos mesmos elementos regulatórios para permitir uma expressão ideal. Essas construções foram então transformadas em E. coli para reconstituir a via de síntese, e o produto heterologosamente produzido poderia então ser purificado e testado para funcionalidade.

Você acabou de ver a visão geral da JoVE sobre engenharia genética. Neste vídeo, discutimos a história da engenharia genética, examinamos grandes questões, ferramentas no campo e apresentamos vários exemplos de aplicações de engenharia genética. Como sempre, obrigado por assistir!