Name: Método otimizado de LC-MS/MS para a análise do elevado-throughput de amostras clínicas de Ivacaftor, seus principais metabolitos e Lumacaftor em fluidos biológicos de pacientes de fibrose cística (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Aprenda um método otimizado de LC-MS/MS para análise de ivacaftor, lumacaftor e metabolitos em amostras clínicas de pacientes com fibrose cística. Esta técnica permite monitoramento terapêutico rápido e sensível.

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J. l. e T.V. são suportados pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (NIAID) dos institutos nacionais de saúde (R01 AI111965). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas ou o National Institutes of Health. MC é um pesquisador australiano NHMRC Principal. J. L. é um australiano de saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (NHMRC) Senior Research Fellow e T.V. é um australiano NHMRC indústria carreira desenvolvimento nível 2 Research Fellow. E.K.S é um nomeado embaixador Young 2017 para ASM (sociedade americana de microbiologia) e é suportado pelo prêmio de pós-graduação australiana. Partes deste trabalho foi apresentado no 12th Australiasian conferência sobre fibrose cística em Melbourne (5-8th de agosto de 2017).

aprovação ética foi obtida da Monash University humano pesquisa ética Comissão (MUHREC).
 1. aplicação do ensaio: coleta de amostra de paciente <ol><li>registrar o tempo quando o paciente toma sua dose padrão de 150 mg ivacaftor ou /lumacaftor de 125 mg de ivacaftor 200 mg.</li>
	<li>Nota para baixo o tempo exato quando a amostra de sangue do paciente é recolhida. 
	Nota: Recomendamos que a coleta de amostras de 4-5 sobre um curso de tempo de 24 h. Se a coleta de única amostra é possível, o ponto do tempo indicado é 2.5-4 h post ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor combinação de dosagem como C máx concentrações no estado estacionário será realizáveis após &#62; 5 dias de tratamento consecutivo.</li>
	<li>Coletar 4-5 mL de sangue em tubos de azuis não tratados comercialmente disponíveis.</li>
	<li>Após a coleta do sangue total, permitem que o sangue a coagular, deixando-a intacta à temperatura ambiente. 
	Nota: Isto normalmente leva 15-30 min.</li>
	<li>Remover o coágulo por centrifugação a 1.000-2.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C em uma centrífuga refrigerada. Designar o sobrenadante resultante como plasma.</li>
	<li>Após centrifugação, imediatamente transferir o sobrenadante (plasma) em um tubo limpo polipropileno usando uma pipeta Pasteur. Rótulo o plasma do tubo com a identificação do paciente (por exemplo, 1 paciente), a droga administrada (por exemplo, combinação de ivacaftor-lumacaftor) e tempo de amostra do paciente foi coletado (por exemplo, pós-dosagem de 2,5 h).</li>
	<li>Amostras de manter a 2-8 ° C durante a manipulação. Uma vez que o tratamento é concluído, armazenar as amostras em &#8211; 20 ° C.</li>
	<li>, Se necessário, enviamos amostras com um mensageiro aprovado ao Instituto analisando. 
	Nota: As amostras estão a ser transferidos em gelo seco até a chegada e devem ser mantidas em &#8211; 80° C até análise.</li>
</ol> 2. Preparação e processamento de amostras efectuadas e normas Nota: Plasma de doadores saudáveis ingênuo para terapia ivacaftor/lumacaftor foi obtido da Cruz Vermelha australiana. Para garantir a integridade, todas as amostras/padrões devem ser mantidos a 2-8 ° C durante a colheita e o processamento. Uma vez que o tratamento é concluído, armazenar as amostras em &#8211; 20 ° C.
<ol><li>Pesar IVA, IVA-carboxilato, hidroximetil-IVA e LUMA, que servirá como referência para as normas internas.</li>
	<li>Preparar duas soluções estoque independentes de cada analito (IVA, M1, M6 e LUMA) em metanol de grau de LC-MS a 100 µ g/mL e 10 µ g/ml. 
	Nota: Compostos expirará após 10 dias sobre a bancada.</li>
	<li>Recém preparar padrões de calibração de LC-MS antes de cada execução analítica por diluição dos padrões de calibração Soluções conservadas em estoque em plasma humano para atingir concentrações na sequência: 0,01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5,0 e 10,0 µ g/mL. Estas amostras são referidas como padrões.</li>
	<li>De precipitar proteínas, preparar 0,1% de ácido fórmico (FA) em acetonitrila (ACN, grau de LC-MS) e deixar na geladeira até ser necessário.</li>
</ol> 3. Pré-tratamento de amostras efectuadas e normas <ol><li>permitir que ambas as amostras de plasma do paciente e em branco equilibrar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Vortex para misturar cada amostra de plasma por 15 s por exemplo.</li>
	<li>Transferir uma alíquota de 100 µ l de qualquer plasma em branco para os padrões ou as amostras para análise em um tubo de polipropileno microcentrifuga 1,5 mL.</li>
	<li>Acrescentar a IVA de padrão interna em cada um dos tubos padrão (por exemplo, 0,01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 e 10,0 µ g/mL para cobrir o intervalo de concentração potencial), feche a tampa e vórtice para 2-3 s. nota que a norma interna é apenas adicionado ao plasma em branco e sem padrão interno é adicionado das amostras.</li>
	<li>Repita o passo 3.4. para os outros padrões internos, M1, M6 e LUMA.</li>
	<li>Spin-down cada tubo brevemente para assegurar que não há nenhum gotículas na tampa.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l da mistura de 0,1% de FA na ACN em cada tubo de precipitar proteínas plasmáticas.</li>
	<li>Vortex a mistura vigorosamente por cerca de 15 s.</li>
	<li>Permitir que tubos repousar durante 10 min na geladeira.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C, se possível.</li>
	<li>Filtrar num filtro de seringa de 13 mm em um frasco HPLC de 1,5 mL uma alíquota de 200 µ l do sobrenadante.</li>
	<li>Transferir 100 µ l do sobrenadante dentro do frasco de LC-MS para a análise de HPLC-MS.</li>
</ol> 4. Análise de HPLC-MS Nota: HPLC-MS a análise foi realizada em um sistema de LC-MS, juntamente com o espectrômetro de massa triplo quadrupolo (tabela 1).
<ol><li>Transformar o sistema de LC-MS, coloque a bandeja com as amostras no autoamostrador.</li>
	<li>Unir a coluna a uma coluna de guarda e se conectar ao sistema de LC-MS.</li>
	<li>Anexar as duas garrafas de fases móveis (frasco r: 100% do Grupo ACN; garrafa b: 0,1% de ácido fórmico na água) e equilibrar o sistema de LC-MS.</li>
	<li>Incorporar os seguintes parâmetros do protocolo de LC-MS.
	<ol><li>Dividir o fluxo de fase móvel antes de entrar o espectrômetro de massa na proporção de 2:1 (resíduos: entrada de MS).</li>
		<li>Realizar uma gradiente eluição com um caudal de 0,5 mL/min usando uma fase móvel composta de 100% do Grupo ACN e 0,1% ácido fórmico em água (inicio em 40: 60, v/v). Note-se que a porcentagem de volume de fase móvel muda ao longo da análise.</li>
		<li>Operar o espectrômetro de massa em um modo de ionização electrospray positivo.</li>
		<li>Certifique-se de que as configurações de LC-MS são os seguintes: tensão de pulverizador de íon 4,5 kV, energia de colisão 295.9 V, gás de nebulização: nitrogênio em 3 L/min; gás de colisão: argônio; secagem gás vazão 20 L/min, lente tensão Q3:-22 V, desolvation temperatura 250 ° C, com um bloco de calor temperatura de 400 ° C.</li>
		<li>Volume de injectar 10 µ l por exemplo.</li>
		<li>Detectar analitos usando múltiplas reação monitoramento (MRM). Monitorar as transições do íon de m/z 392.49 &#8594; 393, m/z 408.49 &#8594; 409, m/z 422.47 &#8594; 423 e m/z 452.40 &#8594; 453 para IVA, IVA-M1, IVA-M6 e LUMA, respectivamente. 
		Nota: O método recém otimizado ainda tem que ser totalmente validado conforme normas FDA.</li>
	</ol></li></ol> 5. As curvas de calibração <ol><li>as curvas de calibração de construção o LC-MS antes de cada corrida analítica, usando a relação entre as proporções de área do pico de cada uma das substâncias a quatro analisar de padrão interno e as concentrações nominais padrão de calibração de ivacaftor (M1-IVA, IVA-M6 ou LUMA) dentro do programa de configurações de LC-MS. 
	Nota: As etapas exatas para a construção da curva de calibração é dependente do modelo de equipamento de LC-MS sendo usado. Essas informações podem estar disponíveis no manual do equipamento.</li>
	<li>Realizar a análise de regressão linear menos-quadrados por ponderação 1/C 2, de acordo com a recíproca das concentrações.</li>
</ol>

<ol><li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-drug+plasma+protein+binding+interactions+of+ivacaftor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor.</a> J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).</li>
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<li>O'Sullivan, B. P., Flume, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+approach+to+lung+disease+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis.</a> Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).</li>
<li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
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<li>Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+N-%282%2C4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl%29-4-oxo-1%2C4-dihydroquinoline-3-carboxamide+%28VX-770%2C+ivacaftor%29%2C+a+potent+and+orally+bioavailable+CFTR+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator.</a> J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).</li>
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<li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+gating+potentiators%2C+including+VX-770%2C+diminish+DeltaF508-CFTR+functional+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>Cholon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiator+ivacaftor+abrogates+pharmacological+correction+of+DeltaF508+CFTR+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>EMA, <a target="_blank" href="http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/003954/human_med_001935.jsp&mid=WC0b01ac058001d124">Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency</a>. , (2015).</li>
<li>VERTEX. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Vertex+prescribing+infomation%22">Vertex prescribing infomation</a>. , (2015).</li>
<li>Matthes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+free+drug+concentration+prevents+inhibition+of+F508del+CFTR+functional+expression+by+the+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor).</a> Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).</li>
<li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+HPLC+and+LC-MS%2FMS+methods+for+the+analysis+of+ivacaftor%2C+its+major+metabolites+and+lumacaftor+in+plasma+and+sputum+of+cystic+fibrosis+patients+treated+with+ORKAMBI+or+KALYDECO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chrom+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO.</a> J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).</li>
<li>Su, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LC-MS%2FMS+method+for+the+quantitation+of+cabozantinib+in+rat+plasma%3A+application+to+a+pharmacokinetic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Como relatado anteriormente, o nosso grupo tem para primeira vez desenvolvido e validado um método HPLC e LC-MS para a rápida detecção e quantificação de ivacaftor e seus principais metabolitos M1 hidroximetil-IVA (ativo) e IVA-carboxilato M6 (inativo); e lumacaftor no plasma e escarro de CF pacientes14. O ensaio relatado anteriormente pelo nosso grupo foi usado com sucesso para quantificar a concentração de LUMA, IVA, IVA-M1 e IVA-M6 no plasma e escarro de pacientes com FC submetidos à terapia pa...

Fibrose cística (CF) é uma doença genética comum, que envolve as glândulas exócrinas muco do pulmão, fígado, pâncreas e intestino causando insuficiência de múltiplos órgão progressiva, como um declínio na função pulmonar e insuficiência pancreática1, 2,3. Ivacaftor (IVA) é o primeiro Food and Drug Administration (FDA-EUA) e a Agência Europeia de medicamentos (EMA) aprovou a droga de potenciador do regulador (CFTR) de condutância de trans-membrana fibrose cística, com eficácia clínica evidenciada, produzindo uma significativa melhora na função pulmonar sobre placebo em um pequeno subconjunto de pacientes com FC tendo o G551D-CFTR [glicina (G) na posição 551 é substituída pelo ácido aspártico (D)] mutação missense (~ 4-5% da população CF)4,5. Esta administrada por via oral a droga aumenta o canal CFTR, abrindo, assim, aumentar o fluxo de íons cloreto e agindo sobre o defeito primário que leva para as manifestações clínicas da CF4,6. Infelizmente, o IVA em monoterapia não é eficaz em pacientes com a mutação mais comum de F508del homozigota [na exclusão de quadro do gene CFTR que resulta na perda de fenilalanina (F) na posição 508] que resulta em misfolded CFTR, o que é visto em ~ 50% de o CF população7,8.
Recentemente, o FDA concedeu aprovação para a combinação de IVA com o corrector CFTR lumacaftor de drogas. A estratégia inteligente de combinar um corrector CFTR (lumacaftor, LUMA) que resgata F508del-CFTR à superfície da célula com um modulador (IVA), que potencializa a atividade de canais CFTR, efetivamente expande a janela de tratamento para a maioria da população CF5 . Dúvidas sobre se essas drogas vão cumprir sua promessa como um número de relatos conflitantes surgiram dúvidas sobre sua eficácia clínica9,10elenco. Além disso, melhorias na função pulmonar foram apenas modesta (2.6-4% para a combinação de ivacaftor-lumacaftor) em comparação com o sucesso alcançado com IVA monoterapia em pacientes tendo um G551D mutação (10.6-12,5%)8. Potenciais interacções medicamentosas antagônica entre IVA e LUMA que potencialmente limitam a eficácia clínica da combinação de ivacaftor-lumacaftor vem de suas propriedades farmacocinéticas ideal menos de7,11. IVA é extensivamente metabolizada pelas enzimas de citocromo P450 (CYP), principalmente para um metabólito ativo hidroximetil-IVA (IVA-M1, M1) e uma forma inactiva IVA-carboxilato (IVA-M6, M6)7,12. O indutor de CYP3A4 LUMA, por outro lado, não é extensivamente metabolizado e é largamente excretado inalterado na fezes11. Como indutores de CYP3A4 induzem o metabolismo do citocromo, concentrações de ivacaftor (substrato de CYP3A4) poderiam ser reduzidas. Além disso, tanto o IVA e LUMA são moléculas muito hidrofóbicas e são ~ 99% ligado às proteínas plasmáticas, que limita significativamente a concentração de droga livre (ativa)1,13.
Coletivamente, esses fatores podem estar chegando juntos para limitar a eficácia clínica da combinação de ivacaftor-lumacaftor. Não se sabe se as concentrações plasmáticas ideais são alcançadas sob o regime de dosagem atual para combinação de ivacaftor-lumacaftor ou se o limiar terapêutico é mantido8. Atualmente, há uma escassez de informações sobre parâmetros farmacocinéticos, como o pico e concentrações plasmáticas de estado estacionário de ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor. Tendo em conta o metabolismo notável de ivacaftor e lumacaftor, monitoramento das relações de exposição-resposta é indispensável para alcançar regimes de dosagem ideal para terapia de ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor. Nosso grupo publicou recentemente o primeiro método HPLC/LC-MS para o monitoramento das relações de exposição-resposta de IVA e LUMA14. Não há técnicas alternativas de medir as concentrações de ivacaftor, seus metabólitos e lumacaftor foram relatadas até à data. Para permitir a análise do elevado-throughput de um coletivo maior do paciente e reduzir drasticamente o tempo de análise, o nosso grupo otimizou o método relatado com o uso de uma coluna de cromatografia de fase reversa de tamanho de poros menor e um sistema de solvente gradiente que reduz custos e tempos de corrida.

<table><tbody><tr><td>IVA (Cat#S114)&nbsp;</td><td>SelleckChem (EUA).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LUMA (Cat#S1565)&nbsp;</td><td>SelleckChem (EUA).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carboxilato de IVA (Cat# 510242247CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (Canadá).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hidroximetil-IVA (Cat# 510240849CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (Canadá).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol (MeOH, grau LC-MS),&nbsp;</td><td>Acetonitrila Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(ACN, grau LC-MS)&nbsp;</td>Ácido fórmico <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(FA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>triplo-quadrupolo Shimadzu 8030 LC-MS&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex (2.6 &micro; m C8 100 &Aring;; 50 &vezes; 2.1mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Filtro em Linha KrudKatcher Ultrea HPLC 0.5 m Filtro de Profundidade x 0.004inID).&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de polipropileno (VWR) de 1,5 mL.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5430</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa de 13 mm (0,45 &micro; m nylon, GRACE, EUA)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 &micro; L, PTFE/Septos de silicone].&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

método otimizado de lc-ms/ms para a análise do elevado-throughput de amostras clínicas de ivacaftor, seus principais metabolitos e lumacaftor em fluidos biológicos de pacientes de fibrose cística

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defeitos no regulador de condutância trans-membrana de fibrose cística (CFTR) são a causa da fibrose cística (CF), uma doença com manifestações pulmonares fatais. Ivacaftor (IVA) e a combinação de ivacaftor-lumacaftor (LUMA) são duas novas drogas descoberta CF que modulam diretamente a atividade e o tráfico da proteína CFTR defeituosa. No entanto, ainda há uma falta de entendimento sobre os parâmetros farmacocinéticos/farmacodinâmicos e a farmacologia do ivacaftor e lumacaftor. A técnica de HPLC-MS para a análise simultânea das concentrações de hidroximetil-ivacaftor, ivacaftor, ivacaftor-carboxilato e lumacaftor em fluidos biológicos em pacientes recebendo a combinação padrão de ivacaftor ou ivacaftor-lumacaftor terapia já havia sido desenvolvido pelo nosso grupo e parcialmente validado para padrões do FDA. No entanto, para permitir a análise da elevado-produção de um maior número de amostras de doentes, nosso grupo otimizou o método relatado com o uso de uma coluna de cromatografia de fase reversa de tamanho de poro menor (2,6 µm, C8 100 Å; 50 x 2.1 mm) e um sistema de solvente gradiente ( 0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: realizada em 70% B; 2,7-2,8 min: 70-90% B; 2.8-lavagem de B 4,0 min: 90%; 4.0-4,1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: realizada em 40% B) em vez de uma eluição isocrática. O objetivo deste estudo foi reduzir o tempo de análise de HPLC-MS por amostra dramaticamente de ~ 15 min para apenas 6 min, por exemplo, que é essencial para a análise de uma grande quantidade de amostras de doentes. Esse método conveniente será de considerável utilidade para estudos nas relações de exposição-resposta dessas drogas de CF de avanço.

Temos recentemente relatado um método validado parcialmente às normas da FDA, em um triplo-quadrupolo LC-MS e um sistema detector HPLC, usando uma coluna C8 (5 µm, identificação de 3,9 mm x 50 mm) com a fase móvel composta de 100% do Grupo ACN e 0,1% ácido fórmico em água (40: 60 v/v) em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Uma correlação linear dos picos observou-se uma faixa de concentração de 0,01 a 10 µ g/mL no plasma humano para todos os metabólitos, ivacaftor, Iva-M1, Iva-M6 e lumacaftor14. Aqui e...

Combinação de Ivacaftor e ivacaftor-lumacaftor são duas novas drogas CF. No entanto, ainda há uma falta de entendimento sobre sua PK/PD e farmacologia. Apresentamos uma técnica de HPLC-MS otimizada para a análise simultânea de ivacaftor e seus principais metabolitos e lumacaftor.

Método otimizado de LC-MS/MS para a análise do elevado-throughput de amostras clínicas de Ivacaftor, seus principais metabolitos e Lumacaftor em fluidos biológicos de pacientes de fibrose cística

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Este é o protocolo para o preparo da amostra para o ensaio de plasma. Observe que, para garantir sua integridade, todas as amostras e padrões devem ser mantidos a dois a oito graus Celsius durante a coleta e o processamento. Após a conclusão do manuseio, armazene todas as amostras a menos 20 graus.Para o preparo padrão, prepare duas soluções-estoque independentes de cada anilida, ivacaftor, metabólito M1, metabólito M6 e lumacaftor em metanol a 100 microgramas por mililitro e 10 microgramas por mililitro. Observe que os compostos expiram após 10 dias em bancada. Para os padrões, transfira 100 microlitros de plasma humano para tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mililitro.Continue fazendo isso para todas as suas outras amostras. Em seguida, adicione o padrão interno a cada tubo. Por exemplo, escolhemos 0,01 micrograma por mililitro do padrão preparado.Agora este tubo contém plasma com o padrão interno adicionado. Proceda da mesma forma com todos os demais padrões. Pegue seus padrões e centrifugue-os por alguns segundos para garantir que todo o líquido esteja na parte inferior do tubo.Continue fazendo isso para todos os seus 40 padrões. Para as amostras dos pacientes, transfira 100 microlitros da amostra do paciente para o tubo de microcentrífuga. A amostra real do paciente não é adicionada com padrão interno.Centrifugue a amostra do paciente por alguns segundos para garantir que todo o líquido esteja na parte inferior do tubo. Os próximos passos são projetados tanto para as amostras quanto para os padrões. Adicione 200 microlitros de ácido fórmico 0,1% em acetonitrila em cada tubo de amostra para precipitar as proteínas plasmáticas.Continue fazendo isso para todos os padrões e amostras de pacientes. Agite vigorosamente cada amostra em vórtex por cerca de 15 segundos. Continue fazendo isso para todos os padrões e amostras obtidas.Deixe repousar por 10 minutos na geladeira para facilitar a precipitação. Para fins demonstrativos, vou centrifugar apenas uma amostra e um padrão. Estamos centrifugando a 10.000 rpm por 10 minutos em uma centrífuga Eppendorf Centrifuge 5430 a quatro graus.Agora filtraremos o sobrenadante nos frascos da Phenomenex. Para isso, estamos utilizando um filtro de seringa de 13 milímetros com filtros de náilon Grace de 0,45 micrômetros adquiridos dos EUA, e estamos filtrando nos frascos de HPLC que podem conter 1,5 mililitro. Após a filtração, transferiremos 100 microlitros do sobrenadante para os frascos de LC/MS para análise por LC/MS.Esta amostra está agora pronta para análise. Basta colocar todas as suas amostras no suporte de frascos. Estamos utilizando um sistema LC/MS Shimadzu 8030, acoplado a um espectrômetro de massas com triplo quadrupolo.Deixe o sistema equilibrar antes da análise. Após o equilíbrio, o que leva cerca de 15 minutos, basta pressionar o botão Iniciar. Para cada metabólito, construa uma curva de calibração plotando as razões das áreas dos picos das anilidas versus a concentração nominal dos padrões de calibração.Utilize a equação de regressão da curva de calibração para calcular as concentrações de anilidas na amostra analisada. Um cromatograma típico é mostrado nesta figura. A resolução cromatográfica otimizada foi obtida utilizando uma fase móvel de acetonitrila 100% e ácido fórmico 0,1% em água, com eluição em gradiente em uma coluna Phenomenex Kinetex C8.Os tempos de retenção na CL foram os seguintes. Para M6, um minuto. Para M1, 1,3 minutos.Para ivacaftor, 1,55 minuto. Para lumacaftor, 2,3 minutos. Em todas as amostras de plasma em branco, nenhuma interferência com o tempo de retenção de qualquer um dos anilídeos foi observada, nem foi detectada interferência da combinação de ivacaftor com lumacaftor.Por meio da análise de alto rendimento de um grande número de amostras de pacientes, otimizamos nosso método descrito anteriormente utilizando uma coluna de cromatografia em fase reversa com tamanho de poro menor, a coluna Phenomenex C8, e um sistema de solvente em gradiente, em vez da eluição isocrática atual. Isso reduz o tempo de análise para seis minutos por amostra, incluindo a fase de lavagem. Este método confiável e inovador oferece uma abordagem simples, sensível e rápida para o monitoramento terapêutico de ivacaftor e da combinação ivacaftor-lumacaftor em fluidos biológicos.Dada a necessidade de desenvolver relações exposição-resposta para maximizar a eficácia dos medicamentos, bem como conter os custos com a saúde, ferramentas mais sensíveis precisam ser desenvolvidas e validadas para auxiliar os clínicos no uso de terapias baseadas em evidências e em técnicas analíticas de alto rendimento para pacientes com fibrose cística. Ao aplicar o método analítico proposto em estudos clínicos de farmacocinética e farmacodinâmica, surge a oportunidade de investigar mais a fundo os parâmetros farmacocinéticos do ivacaftor ou da combinação ivacaftor-lumacaftor em um grupo maior de pacientes.

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Aqui descrevemos um ensaio de cromatografia líquida de alta eficiência-espectrometria de massa em tandem (HPLC-MS/MS) para quantificar o imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco usando uma etapa de precipitação de proteína manual simples e extração em coluna online.

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Competência metabólica de sistemas in vitro é um requisito chave para a biotransformação e disposição de drogas e substâncias tóxicas. Neste protocolo, descrevemos a aplicação de sondas metabólicas referência para avaliar metabolismo de fase I em culturas de células.

Espectrometria de Massa e abordagens baseadas no Luminogenic Caracterizar Fase I Metabolic Competência de<em&gt; In Vitro</em&gt; culturas de células

Aqui, descrevemos um protocolo usando laser captura microdissection juntamente com análise de LC/MS espacialmente-quantificar as distribuições de drogas dentro de granulomas de tuberculose pulmonar. A abordagem tem ampla aplicabilidade para quantificar as concentrações de droga dentro de tecidos em alto detalhe espacial.

Spatial quantificação de drogas em lesões de tuberculose pulmonar por Laser capturar Microdissection líquido cromatografia de espectrometria de massa (LCM-LC/MS)

Aqui nós descrevemos um método de alta produtividade para a fiscalização de drogas abrangente que permite a resolução melhorada e detecção de grandes painéis de drogas de abuso e seus metabolitos, com controle de qualidade baseado na injeção multisegment-capilar eletroforese / espectrometria de massa.

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Filtragem de fragmentação de diagnóstico, implementada em MZmine, é uma abordagem elegante, pós-aquisição para tela LC-MS/MS conjuntos de dados para classes inteiras de produtos naturais conhecidos e desconhecidos. Esta ferramenta procura espectros MS/MS para íons de produto e/ou perdas neutras que o analista definiu como sendo diagnóstico para toda a classe de compostos.

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Aqui, apresentamos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia em reações de síntese de proteínas livres de células. A mistura de síntese livre de células é derivada com aniline para separação eficaz usando cromatografia líquida de fase invertida e, em seguida, quantificada pela espectrometria de massa usando padrões internos isotópicos rotulados.

Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

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Descrito aqui é um protocolo para a determinação de quatro metabólitos triptofanos diferentes gerados na via kynurenine (kynurenine, 3-hidroxikynurenine, ácido xanthurenic, ácido 3-hidroxyanthranilic) no meio coletado de culturas de células cancerosas analisadas por cromatografia líquida acoplada com uma única espectrometria de massa quadrupole.

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Os protocolos descrevem métodos de cromatografia líquida de alto desempenho acoplados ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para estudar reações metabólicas em sistemas complexos de isenta de células baseadas em lysato.

Cromatografia líquida acoplada ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para perfil metabólito em sistemas livres de células baseadas em lysato

Aprenda um método otimizado de LC-MS/MS para análise de ivacaftor, lumacaftor e metabolitos em amostras clínicas de pacientes com fibrose cística. Esta técnica permite monitoramento terapêutico rápido e sensível.

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