Name: Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Aprenda a realizar telas genéticas em pool com CRISPR-Cas9 em células de mamíferos. Este protocolo abrangente permite a interrogação sistemática de funções genômicas usando bibliotecas de sgRNA e análise de dados de sequenciamento.

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Este trabalho foi apoiado pelo genoma do Canadá, o fundo de investigação de Ontário, e os institutos canadenses de pesquisa em saúde (MOP-142375, PJT-148802).

<ol><li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+Structures+and+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).</li>
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<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knock-out+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li>
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<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Essentiality+Profiling+Reveals+Gene+Networks+and+Synthetic+Lethal+Interactions+with+Oncogenic+Ras%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras.</a> Cell. 168 (5), 890-903 (2017).</li>
<li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screens+identify+genomic+ribonucleotides+as+a+source+of+PARP-trapping+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions.</a> Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).</li>
<li>Deans, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+shRNA+and+CRISPR-Cas9+screens+enable+antiviral+drug+target+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification.</a> Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).</li>
<li>Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STBL2%3A+an+Escherichia+coli+strain+for+the+stable+propagation+of+retroviral+clones+and+direct+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences.</a> Focus. 16, 78-80 (1994).</li>
<li>Hart, T., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAGEL%3A+a+computational+framework+for+identifying+essential+genes+from+pooled+library+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens.</a> BMC Bioinformatics. 17, 164(2016).</li>
<li>Wang, G. Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+drug-gene+interactions+from+CRISPR+knock-out+screens+with+drugZ%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ.</a> bioRxiv. , Available from:
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<li>Hartenian, E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+and+functional+genomics+using+CRISPR%2FCas9+technology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology.</a> FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR%2FCas9+knock-out+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens.</a> Genome Biology. 15 (12), 554(2014).</li>
<li>Sheel, A., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Amplifications+Cause+False+Positives+in+CRISPR+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens.</a> Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).</li>
<li>Meyers, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+correction+of+copy+number+effect+improves+specificity+of+CRISPR-Cas9+essentiality+screens+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells.</a> Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).</li>
<li>Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+arrayed+CRISPR-Cas9+library+targeting+epigenetic+regulators%3A+from+high-content+screens+to+in+vivo+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays.</a> Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Devido à sua simplicidade de uso e alta maleabilidade, a tecnologia CRISPR tem sido amplamente adotada como a ferramenta de escolha para a edição precisa do genoma. A triagem de CRISPR agrupada fornece um método para interrogar milhares de perturbações genéticas em um único experimento. Em telas agrupadas, as bibliotecas sgRNA servem como códigos de barras moleculares, pois cada sequência é única e é mapeada para o gene alvo. Isolando o ADN genomic da população da pilha, os genes que causam o phenotype do interesse podem...

CRISPR-CAS, abreviação de repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente e nuclease associada a CRISPR, consiste em uma única proteína nuclease (por exemplo, Cas9) em complexo com um RNA guia sintético (sgRNA). Este complexo de ribonucleoproteína tem como alvo a enzima Cas9 para induzir quebras de DNA de dupla cadeia em um locus genómico específico1. As rupturas dobro-encalhado podem ser reparadas através da reparação dirigida homologia (HDR) ou, mais geralmente, com a junção não-homóloga da extremidade (nhej), um mecanismo de reparo propenso ao erro que resulte na inserção e/ou nos deleções (indels) que interrompem freqüentemente a função do gene a eficiência 1. The e a simplicidade de crispr permitem um nível previamente inatingível da segmentação genomic que ultrapassa distante tecnologias precedentes da edição do genoma [isto é, nucleases do dedo do zinco (ZNF) ou a transcrição ativador-como nucleases do efetoras ( TALENS), ambos sofrem de complexidade de design aumentada, menor eficiência de transfecção e limitações na edição de genes multiplex2].
A aplicação básica da pesquisa da edição do genoma RNA-baseada do único-guia de CRISPR permitiu que os cientistas interrogue eficientemente e barata as funções de genes individuais e topologia de redes genéticas da interação. A habilidade de executar telas funcionais do genoma-largo foi aumentada extremamente pelo uso do sistema de crispr-CAS, particular quando comparado às tecnologias genéticas mais adiantadas do perturbação tais como a interferência do RNA (RNAi) e a mutagenese da armadilha do gene. Em particular, RNAi sofre de efeitos off-Target elevados e knockdown incompleto, resultando em menor sensibilidade e especificidade em comparação com crispr3,4,5, enquanto os métodos de armadilha genética só são viáveis em haplóides células para telas de perda de função, limitando o escopo de modelos de células que podem ser interrogados6. A capacidade de CRISPR para gerar o knock-out completo do gene fornece um sistema mais biologicamente robusto para interrogar fenótipos mutantes, com baixo ruído, efeitos mínimos fora do alvo e atividade consistente em todos os reagentes5. As bibliotecas de crispr-Cas9 sgrna que visam todo o genoma humano estão agora amplamente disponíveis, permitindo a geração simultânea de milhares de knock-outs de genesem um único experimento3,7,8,9 .
Desenvolvemos bibliotecas de lentivirais sgRNA em todo o genoma CRISPR-Cas9, denominadas bibliotecas de Toronto knock-out (TKO) (disponíveis através do Addgene) que são compactas e otimizadas para sequências para facilitar telas de genômica funcional de alta resolução. A mais recente biblioteca, TKOv3, alvos ~ 18.000 genes de codificação de proteínas humanas com 71.090 guias otimizados para a eficiência de edição usando dados empíricos10. Além disso, TKOv3 está disponível como uma biblioteca de um componente (LCV2:: TKOv3, ID de Addgene #90294) expressando Cas9 e sgRNAs em um único vetor, aliviando a necessidade de gerar células de expressão de Cas9 estáveis, permitindo knock-out em todo o genoma em uma ampla gama de tipos de células de mamíferos. TKOv3 também está disponível em um vetor sem Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene ID # 125517) e pode ser utilizado em células que expressam Cas911.
Uma população de células editada em todo o genoma CRISPR-Cas9 pode ser exposta a diferentes condições de crescimento, com a abundância de sgRNAs ao longo do tempo quantificada por sequenciamento de próxima geração, proporcionando uma leitura para avaliar o abandono ou enriquecimento de células com genética rastreável Perturbações. As bibliotecas de knock-out CRISPR podem ser aproveitadas para identificar genes que, após a perturbação, causam defeitos de aptidão celular, sensibilidade moderada à droga (por exemplo, genes sensíveis ou resistentes), regulam a expressão protéica (por exemplo, repórter), ou são necessários para um certo função do caminho e estado celular12,13,14. Por exemplo, as telas diferenciais de aptidão em uma linha celular cancerosa podem identificar tanto depleção ou redução de oncogenes e enriquecimento ou um aumento dos genes supressores de tumor3,14,15. Da mesma forma, o uso de doses intermediárias de fármacos terapêuticos pode revelargenes de resistênciae sensibilização dos fármacos16,17.
Aqui é fornecido um protocolo detalhado de triagem para a triagem de perda de função de CRISPR-Cas9 em escala de genoma usando as bibliotecas de Toronto knock-out (TKOv1 ou V3) em células de mamíferos de geração de biblioteca, desempenho de triagem para análise de dados. Embora esse protocolo tenha sido otimizado para triagem usando as bibliotecas de knock-out de Toronto, ele pode ser aplicado e tornar-se escalável para todas as bibliotecas agrupadas do sgRNA CRISPR.

<table><tbody><tr>Filtro <td></td><td></td><td></td><td>de 0,22 mícron</td></tr><tr><td>30&deg; incubadora</td><td></td><td></td><td></td>de placas C</tr><tr><td>37&deg; C agitando incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&deg; C, 5% CO2 incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>50X tampão TAE</td><td>BioShop</td><td>TAE222.4</td><td></td></tr><tr><td>6 N Solução de ácido clorídrico</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td></td></tr><tr><td>95% Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alamar azul</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminador de luz azul</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino, isolamento de choque térmico, fração V. Min. 98%, grau de biotecnologia</td><td>Bioshop</td><td>ALB001.250</td><td></td></tr><tr><td>Modificação de Dulbecco da Eagles Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>Meios de cultura de células</td></tr><tr><td>Cubetas de eletroporação</td><td>BTX</td><td>45-0134</td><td></td></tr><tr><td>Células eletrocompetentes de Electroporator</td><td>BTX</td><td>45-0651</td><td></td></tr><tr><td>Endura</td><td>Lucigen</td><td>90293</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>GIBCO</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T as pilhas de empacotamento</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>recomendam o número da passagem < 15</td></tr><tr><td>Brometo de hexadimetrina (Polybrene)</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>Polímero catiônico para aumentar a eficiência da transdução</td></tr><tr><td>Placas de ágar brometo de hexadimetrina (Polybrene)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB com carbenicilina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB meio com carbenicilina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escada de DNA de baixo peso molecular</td><td>New England Biolabs</td><td>N3233S</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro Nanodrop</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Q5 Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0544L</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Mídia de soro reduzida</td></tr><tr><td>Kit de purificação maxi de plasmídeo</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G (plasmídeo de envelope)</td><td></td><td>Plasmídeo Addgene #12259</td><td>sistema lentiviral</td></tr><tr><td>psPAX2 (plasmídeo de embalagem)</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td>sistema lentiviral</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Wisent</td><td>400-160-UG</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR ensaio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit fluorômetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C meio de recuperação</td><td>Invitrogen</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>SYRB Safe DNA gel stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 incluído</td><td>Addgene</td><td>Addgene ID #90203</td><td>Biblioteca CRISPR em todo o genoma, inclui Cas9, 71,090 sgRNA</td></tr><tr><td>Biblioteca Toronto KnockOut CRIPSR (TKOv3) - não-cas9</td><td>Addgene</td><td>Addgene ID #125517</td><td>Biblioteca CRISPR em todo o genoma, não-Cas9, solução de 71.090 sgRNA</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE), pH8.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose UltraPure</td> Kit de purificação de DNA genômico <td>ThermoFisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Wizard</td><td>Reagente de</td> transfecção de DNA Promega <td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>06 365 809 001</td><td>Reagente de transfecção à base de lipídios</td></tr></tbody></table>

telas genéticas com base em crispr agrupadas em células de mamíferos

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

A edição do genoma usando o sistema CRISPR-CAS avançou enormente a capacidade de editar precisamente os genomas de vários organismos. No contexto das células de mamíferos, esta tecnologia representa um novo meio para realizar telas genéticas de todo o genoma para estudos de genômica funcional. Bibliotecas de guia RNAs (sgRNA) visando todos os quadros de leitura aberta permitem a geração facile de milhares de perturbações genéticas em um único pool de células que podem ser rastreados para fenótipos específicos para implicar a função gênica e processos celulares em um forma imparcial e sistemática. As telas CRISPR-CAS fornecem aos pesquisadores um método simples, eficiente e barato para descobrir os esquemas genéticos para fenótipos celulares. Além disso, a análise diferencial de telas realizadas em várias linhagens celulares e de diferentes tipos de câncer pode identificar genes que são contextualmente essenciais nas células tumorais, revelando potenciais alvos para terapias anticâncer específicas. A realização de telas de todo o genoma em células humanas pode ser assustadora, pois isso envolve o manuseio de dezenas de milhões de células e requer a análise de grandes conjuntos de dados. Os detalhes dessas telas, como a caracterização da linha celular, as considerações da biblioteca CRISPR e a compreensão das limitações e capacidades da tecnologia CRISPR durante a análise, são muitas vezes negligenciadas. Aqui é fornecido um protocolo detalhado para o desempenho bem-sucedido de telas baseadas em agregados de CRISPR-Cas9 em todo o genoma.

Visão geral do fluxo de trabalho de triagem CRISPR em escala de genoma
A Figura 1 ilustra uma visão geral do fluxo de trabalho de triagem crispr agrupado, começando com a infecção de células-alvo com Lentivirus da biblioteca crispr em um moi baixo para garantir eventos de integração única e representação de biblioteca adequada (tipicamente 200-para 1000 -fold). Após a infecção, as c...

A tecnologia CRISPR-Cas9 fornece um método eficiente para editar precisamente o genoma dos mamíferos em qualquer tipo de célula e representa um novo meio para realizar telas genéticas de todo o genoma. Um protocolo detalhado que discute as etapas necessárias para o desempenho bem-sucedido de telas de CRISPR-Cas9 agrupadas em todo o genoma é fornecido aqui.

Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

As telas de desistência com tela CRISPR fornecem aos pesquisadores um método simples, eficiente e barato para interrogar a função em cadeia no nível de genoma. A vantagem do CRISPR é sua capacidade de editar qualquer gene simplesmente alterando a sequência guia. As bibliotecas guias crispr permitem que os pesquisadores interroguem todo o genoma de qualquer organismo em um experimento de forma imparcial e sistemática.Atualmente, as telas CRISPR estão sendo usadas para identificar genes essenciais em centenas de cânceres humanos e mapear interações genéticas. As telas também podem traçar o perfil abrangente de drogas para revelar mecanismos de ação de drogas. As bibliotecas CRISPR descritas aqui têm como alvo células humanas.No entanto, bibliotecas guias voltadas para outras espécies, como o mouse, estão disponíveis e podem ser rastreadas da mesma forma. A realização de telas em todo o genoma em células humanas pode ser assustadora na prática, pois envolve o manuseio de dezenas de milhões em células e requer a análise de grandes conjuntos de dados. Antes de iniciar uma tela, certifique-se de que as linhas de celular são cuidadosamente caracterizadas.Isso inclui conhecer a pureza da sua linha celular, dobrar o tempo, eficiências de transdução de lentivírus e sensibilidades aos agentes de seleção de antibióticos. Uma demonstração visual fornecerá uma imagem de como praticamente lidar com os milhões de células necessárias em uma tela e acompanhar milhares de perturbações de forma sistemática. Demonstrando o procedimento estarão Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh e Ryan Climie, todos técnicos do meu laboratório.Comece transformando o plasmídeo de sgRNA crispr pronto em células eletrocompetntes e crescendo-as de acordo com as instruções do manuscrito. Quando estiver pronto para colher as colônias, adicione sete mililitros de LB com carbenicilina em cada placa e raspe as colônias com o espalhador de células. Use uma pipeta de 10 mililitros para transferir as células raspadas em um frasco cônico estéril de um litro e enxágue a placa com cinco mililitros de LB com carbenicilina.Novamente, transfira a solução de lavagem para o frasco. Centrifugar as células de acordo com as instruções do manuscrito, e então, determinar o peso da pelota molhada. Purifique o DNA plasmídeo usando um kit de purificação plasmídeo maxi ou mega.Prepare as células para transfecção semeando 293 células T e incubando-as durante a noite. No dia seguinte, prepare a mistura de três plasmídeos de transfecção para placas de 15 centímetros. Calcule a quantidade de plasmídeo necessário para uma transfecção e faça uma mistura de plasmídeos para que o número de placas, mais uma, seja transfeccionada.Em seguida, prepare um reagente de transfecção à base de lipídio para cada transfecção e mídia de soro reduzida por aliquot em tubos individuais de microcentrífuga de 1,5 mililitro para o número de placas a serem transfecidas. Adicione o reagente de transfecção, misture delicadamente e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação, adicione DNA ao reagente de transfecção em uma proporção de três para um reagente de transfecção para microgramas do complexo de DNA.Misture a solução suavemente e deixe em temperatura ambiente por 30 minutos. Adicione a mistura de transfecção às células de embalagem e incuba-as de acordo com as instruções do manuscrito. No dia da colheita viral, verifique as células quanto à morfologia anormal e fundida como uma indicação de boa produção de vírus, e colmeia o lentivírus coletando o supernante e transferindo-o para um tubo de centrífuga estéril.Comece selecionando a cobertura da biblioteca do guia CRISPR RNA para ser mantida em toda a tela. Com base na cobertura da biblioteca, determine o número de células necessárias para mantê-la por guia RNA e o número de células necessárias para infecção no MOI 0.3. Em seguida, determine o número de placas necessárias para configurar a infecção e, em seguida, colher e semear as células em cada placa.Adicione brometo de hexadimethrina a todas as placas e adicione o volume necessário de vírus para triagem e controle de duas placas. Não adicione vírus para controlar um. Substitua esse volume por mídia.Misture bem as placas inclinando e coloque as placas em uma incubadora, certificando-se de que elas estão niveladas. Colher células infectadas de acordo com as instruções do manuscrito e coletar três réplicas de pelotas celulares das células agrupadas para extração genômica de DNA. Centrifugar as células a 500 vezes g durante cinco minutos e lavá-las com PBS.Rotule os tubos e congele as pelotas celulares a menos 80 graus Celsius. Divida o pool de células infectadas em três grupos de replicação, certificando-se de manter a cobertura da biblioteca dentro de cada réplica. Semear as células a uma densidade que normalmente seria usada ao expandi-las.Use o mesmo número de células para cada réplica e o mesmo número total de células entre as réplicas. Continue a passagem das células e colher três réplicas de pelotas celulares de cada réplica de células infectadas agrupadas para até 15 a 20 duplicações celulares. Em cada passagem, colhe as células de todas as placas em cada réplica entre si.Rotule cada pelota com o tempo e replique a designação. Configure o PCR1 de acordo com as instruções do manuscrito com um total de 100 microgramas de DNA genômico a 3,5 microgramas de DNA genômico por reação de 50 microliteras e configure reações idênticas de 50 microliteras para alcançar a cobertura desejada. Configure uma reação do tubo PCR de acordo com as instruções do manuscrito.Use cinco microliters do produto PCR1 agrupado como modelo e use combinações de primer de índice exclusivas para cada amostra individual para permitir o agrupamento de amostras de biblioteca de sequenciamento. Depois de completar o PCR, execute o produto do tubo PCR em um gel de 2% de agarose em baixa tensão por uma a 1 1/2 horas. Visualize o produto em um transilluminador de luz azul e extireta a banda de 200 pares base.Purificar o DNA e medir sua quantidade e qualidade com um espectotógrafo e um fluorômetro. Uma biblioteca RNA guia ideal deve ter cada guia RNA representado em quantidades semelhantes. O sequenciamento da próxima geração pode ser usado para confirmar que a biblioteca tem uma distribuição apertada de RNAs guia.A análise de recall de precisão pode ser usada para avaliar o desempenho da tela. Uma tela de alto desempenho deve recuperar um grande número de genes essenciais em um fator base maior que seis e uma falsa taxa de descoberta inferior a 5% A curva de retirada de precisão deve ter um cotovelo afiado e uma linha reta até o ponto terminal. O fator Bayes representa uma medida de confiança que o nocaute genético resulta em um defeito de aptidão.Pontuações altas indicam aumento da confiança, enquanto pontuações baixas sugerem que o nocaute genético oferece vantagens de crescimento. Piscinas de nocaute em todo o genoma podem ser cultivadas na presença de agentes de drogas em excesso para procurar genes de resistência supressora. Para realizar uma tela de seleção positiva para supressor do bloco de timmidina, as contagens de leitura normalizadas para todos os RNAs guiados no T0 são plotadas contra contagens de leituras normalizadas para amostras tratadas com timmidina.Um detalhe fundamental para a realização com sucesso de telas CRISPR é manter uma boa distribuição de cada RNA guia, desde a transfecção do plasmídeo até a transdução de células. Isso minimizará a chance de efeitos aleatórios que podem distorcer a representação do RNA e levar a resultados falsos positivos ou negativos. Após uma validação da tela, os experimentos devem ser feitos para confirmar os hits porque a tela principal só identifica possíveis acertos.Dependendo da biologia dos hits, vários métodos podem ser usados. A edição crispr, combinada com o sequenciamento de próxima geração, permitiu a perda em escala de genoma de telas de função em diversos sistemas de modelos humanos. Devido à simplicidade do CRISPR, esses tipos de telas são agora amplamente acessíveis a todos os pesquisadores, permitindo que mais cientistas utilizem métodos genéticos funcionais para estudar processos biológicos e doenças.

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