Name: Detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus implantável em campo usando amplificação de recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprenda a detectar Candidatus Liberibacter asiaticus em campo usando amplificação por recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a. Este método portátil oferece diagnóstico rápido e sensível para o greening dos citros.

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Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Programa Nacional de P & D da China (2021YFD1400805), o Programa de P & D de Ciência e Tecnologia da Província de Jiangxi (20194ABC28007), Projetos do Departamento de Educação de Jiangxi (GJJ201449) e a Inovação Colaborativa da Pesquisa Científica Agrícola Moderna na Província de Jiangxi (JXXTCX2015002(3+2)-003).

1. Construção do CLas-DETECTR
NOTA: A construção do CLas-DETECTR é um processo de quatro etapas: preparação da solução, isolamento do DNA total dos citros, amplificação isotérmica do DNA e visualização dos resultados. O esquema do ensaio CLas-DETECTR é ilustrado na Figura 1A.
<ol><li>Preparação da solução<ol><li>Preparar tampão A: 20 mM de NaOH em 6% de PEG 200. Para 100 ml, adicione 113 mg de NaOH e 6 g de PEG 200 em 80 ml de H2O num frasco. Incubar o frasco em banho-maria a 60 °C até que todo o PEG 200 esteja dissolvido. Em seguida, adicione H2O a um volume de 100 mL.</li>
		<li>Preparar a solução B: Para cada reacção, adicionar 10 μL de tampão RPA, 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de R-RPA-RNRr e 3,9 μL de ddH2O a um volume final de 15,5 μL. NOTA: F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr são os primers utilizados no ensaio contra o gene nrdB . Consulte a Tabela 1 para a sequência.</li>
		<li>Preparar a solução C: Para cada reacção, adicionar 1 μL de ssDNA reporter, 3 μL de tampão NEB 3.1, 1 μL de crRNA, 4 μL de Cas12a e 11 μL de ddH2O a um volume final de 20 μL. NOTA: Se houver muitas amostras para detectar, faça um grande volume de solução B e solução C e alíquota mais tarde.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento do DNA total dos citros NOTA: Para economizar tempo e tornar este método adequado para a detecção de CLas de campo, a abordagem alcalina à base de polietilenoglicol (PEG) foi utilizada para a obtenção de extratos brutos de plantas para amplificação de DNA22,23<ol><li>Folhas cítricas foram utilizadas neste protocolo. Primeiro, soque cinco discos de folha de uma folha. Em seguida, coloque os discos foliares em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione 200 μL de tampão A. NOTA: No campo, limpe as folhas primeiro se houver poeira cobrindo-as. Os discos foliares podem ser cortados usando a tampa do tubo de 1,5 mL para evitar a contaminação cruzada. Outros tecidos cítricos, como raízes, caules, frutos e flores, também podem ser utilizados neste protocolo.</li>
		<li>Moer os discos das folhas manualmente até alisar com uma haste de plástico.</li>
		<li>Deixe o tubo intacto por 10 min. Em seguida, use o sobrenadante para amplificação do DNA. NOTA: O ensaio pode ser pausado aqui, e os extratos de plantas brutas que foram extraídos pelo método alcalino-PEG podem ser armazenados a -20 °C por pelo menos 1 ano. As árvores de laranja doce de Newhall (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) mostradas no vídeo foram cultivadas em um vaso preenchido com uma mistura de 9/3/1 (v/v/v) solo de turfa/vermiculita/perlita e mantidas em uma estufa localizada no campus da Universidade Normal de Gannan, Jiangxi, China. As árvores infectadas pelo HLB foram inoculadas por enxertia com brotos de Newhall CLas-positivos. As árvores infectadas e não infectadas pelo HLB foram confirmadas por PCR. A CLas foi detectada usando o par de iniciadores (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) visando o gene nrdB marcador específico da CLas. Por outro lado, sintomas característicos de HLB, manchas manchadas e folhas amareladas podem ser encontrados em árvores CLas-positivas, mas não em árvores CLas-negativas.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplificação isotérmica do DNA<ol><li>Adicionar 1 μL do sobrenadante da etapa 1.2.3 e 1 μL de MgOAc (concentração final de 14 mM) à solução B e misturar bem.</li>
		<li>No laboratório, incube-os em uma incubadora simples a 37 °C por 15 min. NOTA: No campo, segure os tubos na mão por 15 min. Sugere-se também incubar tubos em uma incubadora simples a 37 °C por 15 min, se as condições permitirem.</li>
	</ol></li>
	<li>Visualização de resultados<ol><li>Adicionar 10 μL da mistura da fase 1.3.2 à solução C e misturar bem.</li>
		<li>Incubá-los em uma incubadora de 37 °C por 60 min.</li>
		<li>Use óculos de proteção e observe o sinal de fluorescência verde liberado do repórter ssDNA rotulado com 5' 6-Fluoresceína a 5' e o quencher de fluorescência a 3' através de um dispositivo portátil de detecção fluorescente (comprimento de onda de excitação: 440 nm, comprimento de onda de emissão: 500 nm). NOTA: sinal de fluorescência verde pode durar vários dias, é melhor CUIDADO: A luz emitida pelo dispositivo de detecção de fluorescência é prejudicial aos olhos. Certifique-se de usar óculos antes de observar os resultados.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Teste de especificidade
NOTA: Para testar a especificidade do CLas-DETECTR, a bactéria rizosfera Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) e Burkholderia stabilis cepa 1440 isoladas no laboratório24 foram submetidas ao teste CLas-DETECTR.
NOTA: Candidatus Liberibacter (CLas) não pode ser cultivado. Só se pode obter DNA CLas a partir da extração de DNA genômico de tecidos cítricos infectados com CLas. Xcc é o agente causal de outra importante doença cítrica, o cancro cítrico. Burkholderia stabilis cepa 1440 é uma bactéria anti-Xcc isolada em laboratório. Portanto, cepas puras para todas essas três bactérias foram usadas.
<ol><li>Extraia o DNA genômico bacteriano (gDNA) usando um kit de extração de DNA genômico bacteriano seguindo o protocolo do fabricante. Use a água como um controle negativo.</li>
	<li>Realizar PCR utilizando tiras de tubo de PCR de 0,2 mL com tampas ópticas em uma mistura de reação de 25 μL contendo 1 μL de F-RPA-RNRf, 1 μL de R-RPA-RNRr, 12,5 μL de Ex Taq Versão 2.0 mais corante, 1 μL de molde de DNA e 9,5 μL de H2O.<ol><li>Utilizar as seguintes condições de reacção de ciclo térmico: 1 min a 98 °C; seguido de 35 ciclos de 10 s a 98 °C, 30 s a 55 °C, 15 s a 72 °C; em seguida, 10 min a 72 °C; e segurar a 16 °C.</li>
		<li>Execute os produtos de PCR em gel de agarose a 1% a 120 V por 15 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar qPCR em uma mistura de reação de 20 μL contendo 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de R-RPA-RNRr, 10 μL de 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL do molde de DNA e 7,4 μL de H2O.<ol><li>Utilizar as seguintes condições de reacção de ciclo térmico: 30 s a 95 °C; seguido de 45 ciclos de 5 s a 95 °C e 32 s a 60 °C; e, em seguida, um estágio de curva de fusão de 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C e 15 s a 95 °C.</li>
		<li>Inclua três repetições técnicas em cada repetição.</li>
	</ol></li>
	<li>Execute o método CLas-DETECTR seguindo as etapas 1.1–1.4.</li>
</ol>3. Comparação de sensibilidade
<ol><li>Para testar a sensibilidade do CLas DETECTR, detecte uma série de diluições de fragmentos de DNA CLas usando PCR, CLas-DETECTR e qPCR, conforme descrito acima.</li>
	<li>Amplificar um segmento de DNA com um comprimento de 1.060 pb de nrdB usando o conjunto de iniciadores F-RNR e R-RNR em uma mistura de reação de 100 μL contendo 4 μL de F-RNR, 4 μL de R-RNR, 50 μL de PrimeSTAR Max Premix, 2 μL de molde de DNA e 40 μL de H2O, seguindo as condições de reação de ciclo térmico (30 s a 98 °C; seguido por 35 ciclos de 10 s a 98 °C, 15 s a 55 °C, 30 s a 72 °C; em seguida, 10 min a 72 °C; e segurar a 16 °C). NOTA: O gene nrdB (ribonucleotídeo redutase β- subunidade) é específico para CLas21. Pode-se facilmente obter o amplificador nrdB do gDNA cítrico CLas positivo usando o conjunto de primer F-RNR e R-RNR. O conjunto de iniciadores F-RNR e R-RNR amplifica um fragmento nrdB de 1.060 pb, enquanto o conjunto de primer F-RPA-RNR e R-RPA-RNR amplifica um fragmento de 104 pb do gene nrdB, que é a parte do fragmento nrdB de 1.060 pb.</li>
	<li>Purifice os produtos de PCR com um kit de extração de gel de DNA seguindo o manual do fabricante.</li>
	<li>Diluir os produtos de PCR que contêm os amplificadores nrdB com ddH2O esterilizado.</li>
	<li>Calcule o número de cópias do gene nrdB usando o número de cópia de DNA on-line comercialmente disponível e a calculadora de diluição.</li>
	<li>Preparar diluições de ADN contendo 2,01 × 106 cópias/μL, 2,01 × 105 cópias/μL, 2,01 × 104 cópias/μL, 2,01 × 103 cópias/μL, 2,01 × 10 2 cópias/μL, 2,01 × 101 cópias/μL, 2,01 × 100 cópias/μL e2,01 × 10−1 cópias/μL de fragmento de ADN CLas.</li>
</ol>4. Detecção de amostras
NOTA: Após o teste de especificidade e sensibilidade, o método CLas-DETECTR foi utilizado para detectar a presença de CLas nas amostras de folhas de campo coletadas de laranjeiras doces Newhall cultivadas no viveiro de recursos de germoplasma no campus da Universidade Normal de Gannan, Jiangxi, China. Uma qPCR foi realizada para verificar os resultados.
<ol><li>Teste um total de 15 árvores. Use a água como um controle negativo.</li>
	<li>Execute os métodos CLas-DETECTR e qPCR conforme descrito acima. NOTA: Devido às características de distribuição desigual da CLas em citros, as folhas com sintomas de HLB foram coletadas prioritariamente. Se uma árvore parecia saudável, as folhas foram coletadas aleatoriamenteCLas-DETECTR sistema funciona corretamente.</li>
</ol>

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<li>Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nested-PCR+detection+and+sequence+confirmation+of+%27Candidatus+Liberibacter+asiaticus%27+from+Murraya+paniculata+in+Guandong%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China.</a> Plant Disease. 91 (8), 1051(2007).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Este estudo apresenta um método rápido e portátil para detecção de CLas denominado CLas-DETECTR, que combina os sistemas RPA e CRISPR-Cas12a. O fluxo de trabalho é ilustrado na Figura 1. O CLas-DETECTR detecta CLas com especificidade e sensibilidade (Figura 2 e Figura 3). Além disso, usando amostras de folhas de Newhall, o CLas-DETECTR detecta CLas com a mesma sensibilidade que a qPCR (Figura 4<...

O Huanglongbing (HLB) é uma das doenças cítricas mais problemáticas do mundo1. O HLB é causado pela bactéria colonizadora de floemas e fastidiosa Candidatus Liberibacter spp., incluindo Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus e Ca. L. americanus 2. A espécie associada ao HLB mais prevalente na China e nos EUA é a CLas, que é transmitida por psilídeos cítricos asiáticos (Diaphorina citri) ou por enxerto3. Após serem infectadas por CLas, as árvores cítricas demonstram declínio de crescimento até a morte2. Os sintomas comuns das folhas cítricas infectadas com CLas são manchas manchadas, ilhas verdes (pequenos pontos circulares verde-escuros), veias de cortiça levantadas em folhas mais grossas e coriáceas e brotos amarelados não uniformes2. Além disso, os frutos infectados com CLas parecem pequenos e desequilibrados2.
Como nenhuma variedade cítrica é resistente ao HLB e não há cura terapêutica para o HLB, a prevenção do HLB requer a quarentena e o isolamento de citros CLas-positivos 2,3. Portanto, a detecção precoce é fundamental para o monitoramento e a quarentena para evitar a disseminação de CLas e minimizar as perdas econômicas3. Além disso, a detecção de CLas sensíveis é necessária devido ao baixo título de CLas em plantas durante o estágio inicial da infecção3. Na China, a detecção de CLas é geralmente conduzida por certos centros de teste certificados. No entanto, o processo de detecção geralmente leva pelo menos 1 semana, e a taxa de detecção é cara. Portanto, para ajudar a monitorar a incidência de HLB
Diversas tecnologias têm sido aplicadas para diagnosticar o HLB 4,5,6,7,8,9. A reação em cadeia da polimerase (PCR) e a PCR quantitativa (qPCR) são as ferramentas mais utilizadas para a detecção de CLas devido à sua alta sensibilidade e especificidade 4,5. No entanto, essas tecnologias dependem fortemente de instrumentos caros e pessoal altamente qualificado. Além disso, vários métodos de amplificação isotérmica, como a amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), têm sido desenvolvidos como alternativas atraentes aos métodos convencionais de PCR devido à sua simplicidade, rapidez e baixo custo 8,9,10. No entanto, é um desafio aplicá-los para detectar com precisão CLas devido aos sinais de amplificação não específicos, o que pode causar resultados falso-positivos.
A detecção de ácido nucleico à base de endonuclease CRISPR/Cas guiada por RNA (repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas/associadas a CRISPR) foi desenvolvida como uma tecnologia de diagnóstico molecular de última geração devido à sua alta sensibilidade, especificidade e confiabilidade 11,12,13,14. Essas tecnologias de diagnóstico CRISPR/Cas dependem da atividade nuclease colateral das proteínas Cas para clivar o DNA de fita simples (ssDNA) modificado com um repórter fluorescente e um quencher de fluorescência em cada extremidade dos oligonucleotídeos, bem como um dispositivo de detecção de fluorescência para capturar o repórter fluorescente liberado11,12 . A atividade nuclease de vários efetores de Cas ativados pelo duplex alvo de RNA CRISPR (crRNA) pode clivar indiscriminadamente o ssDNA não-alvo circundante11. O CRISPR-Cas12a (também chamado de Cpf 1), um sistema CRISPR/CAS tipo classe 2 do tipo 2, demonstra diversas vantagens em relação ao Cas9, como menor tolerância à incompatibilidade e maior especificidade13. O sistema Cas12a/crRNA tem sido aplicado para a detecção sensível e específica dos ácidos nucleicos de patógenos e fitopatógenos humanos 14,15,16,17,18. Portanto, a utilização do sistema Cas12a/crRNA deve permitir a detecção precisa e sensível do ácido nucleico de CLas.
Cas12a sozinho não é teoricamente sensível o suficiente para detectar baixos níveis de ácidos nucleicos. Portanto, para melhorar sua sensibilidade de detecção, a detecção de CRISPR-Cas12a é tipicamente combinada com uma etapa de amplificação isotérmica14,15. A amplificação da recombinase polimerase (RPA) permite a amplificação sensível e rápida do DNA isotérmico em uma faixa de temperatura de 37 °C a 42 °C19.
Uma plataforma de detecção chamada DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) que combina a atividade da DNase de Cas12a com RPA e uma leitura de fluorescência foi recentemente concebida12 e demonstrou detectar ácido nucleico com maior sensibilidade20. Além disso, o sinal de fluorescência emitido pelas amostras positivas pode ser observado através de um dispositivo portátil de detecção de fluorescência no campo.
Como amplificamos o DNA com RPA, projetamos crRNA visando o gene nrdB de cinco cópias (ribonucleotídeo redutase β- subunidade) específico para CLas21 e empregamos a atividade DNase da proteína Cas12a, chamamos esse método de detecção de CLas de CLas-DETECTR. Em comparação com os métodos de detecção CLas existentes, o CLas-DETECTR é rápido, preciso, sensível e implantável.

<table><tbody><tr><td>Kit de Extração de DNA Gel AxyPrep</td><td>Corning</td><td>09319KE1</td><td></td></tr><tr><td>China Kit de Extração de DNA Genômico Bacteriano</td><td>Solarbio</td><td>D1600</td><td>China</td></tr><tr><td>EnGen LbCas12a&nbsp;</td><td>TOLOBIO</td><td>32104-01</td><td>China</td></tr><tr><td>Ex Taq Versão 2.0 plus corante</td><td>TaKaRa</td><td>RR902A</td><td>China</td></tr><tr><td>Dispositivo de detecção fluorescente portátil&nbsp;</td><td>LUYOR</td><td>3415RG</td><td></td></tr><tr><td>China Furador de furos&nbsp;</td><td>Deli</td><td>114</td><td>China</td></tr><tr><td>Acetato de magnésio, MgOAc</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td>UK</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SCR</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>China NEB buffer 3.1&nbsp;</td>Tubos de tira de PCR <td>NEB</td><td>B7203</td><td></td></tr><tr><td>EUA</td><td>LABSELECT</td><td>PST-0208-FT-C</td><td>China</td></tr><tr><td>PEG 200&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3015</td><td>USA</td></tr><tr><td>PrimeSTAR Max DNA Polymeras</td><td>TaKaRa</td><td>R045A</td><td>China</td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>N0550S</td><td>EUA</td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td><td>TaKaRa</td><td>RR820B</td><td>China</td></tr><tr><td>TwistAmp Basic</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td>Reino Unido</td></tr></tbody></table>

detecção de candidatus liberibacter asiaticus implantável em campo usando amplificação de recombinase polimerase combinada com crispr-cas12a

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

A detecção precoce de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) por citricultores facilita a intervenção precoce e previne a propagação da doença. Um método simples para o diagnóstico rápido e portátil de Huanglongbing (HLB) é apresentado aqui que combina amplificação da recombinase polimerase e um repórter fluorescente utilizando a atividade nuclease do sistema palindrômico curto agrupado regularmente interespaçado/CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a). A sensibilidade desta técnica é muito maior do que a PCR. Além disso, este método mostrou resultados semelhantes à qPCR quando as amostras foliares foram utilizadas. Em comparação com os métodos convencionais de detecção de CLas, o método de detecção aqui apresentado pode ser concluído em 90 min e funciona em uma condição isotérmica que não requer o uso de máquinas de PCR. Além disso, os resultados podem ser visualizados através de um dispositivo portátil de detecção fluorescente no campo.

Aqui, descrevemos uma plataforma portátil, CLas-DETECTR, que vasculha os sistemas RPA e CRISPR-Cas12a para diagnosticar o HLB em campo. O esquema do CLas-DETECTR é ilustrado na Figura 1A.
Quando amostras foliares das árvores de Newhall infectadas e não infectadas por HLB (Figura 1B), para as quais a presença de CLas foi confirmada por PCR (Figura 1C), foram submetidas ao teste CLas-DETECTR, observou-se sinal de fluorescência verde na amostra infectada por HLB, mas...

Neste trabalho, foi desenvolvido um método de detecção rápido, sensível e portátil de Candidatus Liberibacter asiaticus baseado na amplificação da recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a.

Detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus implantável em campo usando amplificação de recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Huang long bing, abreviado como HLB. É uma doença cítrica devastadora em todo o mundo. Nos países mais produtores de citros, como a China e os EUA, o HLB é causado pela bactéria restrita ao floema Candidatus Liberibacter asiaticus, abreviada como CLas.A detecção precoce de CLas foi importante para os produtores, facilitando a intervenção precoce e prevenindo a propagação da doença. Então, aqui desenvolvemos um novo método para o diagnóstico rápido e portátil de HLB, combinando com a amplificação da recombinase polimerase e o sistema CRISPR-Cas12a. Nós o chamamos de CLas-DETECTR.A sensibilidade da nossa plataforma é muito maior do que a PCR. Além disso, apresenta resultado semelhante com qPCR quando as amostras foliares foram utilizadas. Comparando com as detecções CLas convencionais, nosso método pode ser concluído em 90 minutos e funciona em uma condição isotérmica.O resultado também pode ser visualizado através de um dispositivo portátil de detecção fluorescente no campo. O CLas-DETECTR contém quatro etapas: preparação da solução, isolamento do DNA total dos citros, amplificação isotérmica do DNA e os resultados da visualização. O esquema do ensaio CLas-DETECTR é ilustrado aqui.O buffer A, a solução B e a solução C são preparados conforme descrito no protocolo. Para economizar tempo e tornar este método adequado para a detecção de CLas de campo, a abordagem à base de polietilenoglicol E.coli foi usada para obter extratos brutos de plantas para amplificação de DNA. As folhas cítricas são usadas na ferramenta.Soque os poucos pedaços de discos de folha de folha. Coloque os discos de folha em um tubo Eppendorf de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão A no tubo.Moer os discos foliares até ficarem lisos com uma haste de plástico manualmente. Deixe o tubo intacto por 10 minutos. O sobrenadante é subsequentemente aplicado à amplificação do DNA.Para amplificação isotérmica do DNA, adicione um microlitro de sobrenadante da etapa 2.3 e um microlitro de acetato de magnésio na Solução B e misture bem. No laboratório, incube-os em uma incubadora simples a 37 graus por 15 minutos. Para visualizar os resultados, adicione 10 microlitros da mistura da etapa 3.2 na Solução C e misture bem.Incube-os na incubadora de 37 graus por 60 minutos. Use um óculos e observe o sinal de fluorescência verde através de um dispositivo de detecção fluorescente portátil. Para testar a especificidade do CLas-DETECTR, primeiras colônias puras de Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.citri que é o patógeno do cancro cítrico e Burkholderia stabilis cepa 1440 isolada em nosso laboratório foram utilizados para extrair seu DNA genômico. Em seguida, este DNA genômico de três bactérias e o DNA genômico de folhas de Newhall CLas positivo foram submetidos ao teste CLas-DETECTR. Para testar a sensibilidade do CLas-DETECTR, uma série de diluições de fragmentos de DNA de CLas foram detectadas usando PCR, CLas-DETECTR e qPCR, conforme descrito no protocolo Após o teste de especificidade e sensibilidade, o método CLas-DETECTR foi usado para detectar a presença do CLas em campo.Amostras de folhas coletadas da laranjeira doce Newhall cultivada no viveiro de recursos de germoplasma no campus da Universidade Normal de Gannan, Jiangxi, China. qPCR, um método convincente de detecção de CLas geralmente usado no laboratório também foi aplicado. As amostras foliares da árvore de Newhall infectada e não infectada pelo HLB, nas quais a presença do CLas foi confirmada em nosso laboratório, foram submetidas ao teste CLas-DETECTR.O sinal de fluorescência verde foi capturado na amostra infectada pelo HLB, mas não no controle negativo e não infectado pelo HLB. Determinamos a especificidade do CLas-DETECTR utilizando ácidos nucleicos extraídos de outras bactérias. No ensaio CLas-DETECTR, apenas o gDNA extraído de folhas de Newhall CLas-positivas demonstrou sinais fluorescentes verdes.gDNA extraído de Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri e Burkholderia stabilis cepa 1440 não, o que significa que o CLas-DETECTR pode detectar CLas especificamente. Também testamos a sensibilidade do CLas-DETECTR usando uma série de diluições de DNA CLas, listadas no protocolo.PCR pode detectar 201 cópias por megalitro. Por outro lado, o CLas-DETECTR pode detectar 2,01 cópias por megalitro, sugerindo sua disponibilidade como um diagnóstico de campo sensível. qPCR pode detectar 0,201 cópias por megalitro e o valor de Ct é superior a 36.Assim, o CLas-DETECTR é duas ordens de magnitude mais sensível que a PCR tradicional e uma ordem de magnitude menos sensível que a qPCR quando foram utilizados amplificadores específicos de CLas diluídos. Finalmente, reexaminou a viabilidade do CLas-DETECTR para amostras de campo e comparou sua sensibilidade com a qPCR. Em números, vemos.Podemos ver que o valor de Ct é superior a 36 quando a concentração de CLas é inferior a 0,2 cópias por megalitro, o que é uma concentração muito baixa. Dentre as 15 amostras, o valor de Ct das amostras 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 e 14 detectadas por qPCR foi inferior a 36. Observou-se um sinal de fluorescência verde aparente.Por outro lado, quando o valor de Ct das amostras 6, 7, 9, 12 e 15 detectado por qPCR foi indeterminado, não foram observados sinais fluorescentes verdes. Além disso, sinais fluorescentes verdes fracos foram observados quando o valor da TC das amostras 5 e 11 detectado pela qPCR foi superior a 36. Os resultados sugerirão que nossa plataforma é uma ferramenta rápida, robusta e sensível para o diagnóstico de HLB no campo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Sistemas CRISPR-Cas e proteínas anti-CRISPR foram integrados ao esquema de portões booleanos em Saccharomyces cerevisiae. Os novos circuitos lógicos pequenos mostraram bom desempenho e aprofundaram a compreensão dos fatores de transcrição baseados em dCas9/dCas12a e das propriedades das proteínas anti-CRISPR.

Circuitos Digitais Gênicos Baseados em Sistemas CRISPR-Cas e Proteínas Anti-CRISPR

Apresentamos um protocolo que combina amplificação da polimerase recombinase com um sistema CRISPR/Cas12a para detecção de traços de vírus de DNA e constrói microscopia portátil para smartphone com uma classificação assistida por inteligência artificial para detecção de vírus de DNA no local de atendimento.

Sistema de detecção de vírus de DNA baseado em RPA-CRISPR/Cas12a-SPM e aprendizado profundo

Aqui, apresentamos a preparação passo a passo de amplificação isotérmica baseada em recombinase liofilizada pré-misturada e reações baseadas em Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), que podem ser usadas para a detecção de biomarcadores de ácido nucleico de patógenos de doenças infecciosas ou outros marcadores genéticos de interesse.

Diagnóstico baseado em CRISPR no local de atendimento com reagentes pré-misturados e liofilizados

Para facilitar a detecção rápida e precisa de Acinetobacter baumannii, apresentamos um protocolo que emprega a amplificação da polimerase recombinase (RPA) em conjunto com a endonuclease LbaCas12a para identificar infecções por A. baumannii .

Detecção rápida e específica de infecções por Acinetobacter baumannii usando um sistema baseado em amplificação da polimerase recombinase/Cas12a

Neste protocolo, um ensaio combinado de amplificação da polimerase recombinase CRISPR/Cas12a é ilustrado para a detecção do patógeno invasor da planta, Fusarium oxysporum f. sp. cubense raça tropical 4.

Ensaio CRISPR/Cas12a de amplificação da polimerase recombinase combinada para detecção de Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

Aqui, descrevemos um procedimento simples e rápido para detectar DNA de patógenos de abelhas, como Lotmaria passim e Nosema ceranae, usando uma lise celular pronta para amplificação, amplificação da polimerase recombinase e ensaios CRISPR/Cas12a.

Detecção de DNA no local de parasitas tripanossomatídeos e Nosema ceranae por meio de lise alcalina acoplada ao sistema RPA/CRISPR/Cas12a

Este vídeo mostra as técnicas para a rotulagem de células-tronco embrionárias e células-tronco mesenquimais com corantes fluorescentes. Esta técnica pode ser usada para um monitoramento in vivo de células-tronco transplantadas com imagens ópticas e para as correlações histopatológico com microscopia de fluorescência.

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

O advento da tecnologia local específico recombinase (SSR) eo sistema Cre / lox tem levado a inúmeros avanços em biologia molecular, e provou-se como uma valiosa ferramenta para avaliar a função do gene em animais transgênicos. Esta entrevista aborda o mecanismo de recombinação sítio específica por Ciclização recombinase (CRE) e como o uso desta enzima tem levado ao desenvolvimento de mutagênese condicional, que tem vantagens significativas sobre os tradicionais knock out estratégias.

Princípios do site-specific Recombinase (SSR) Tecnologia

Aqui nós relatamos a geração de Tre recombinase através dirigido evolução, molecular. Tre recombinase reconhece uma seqüência alvo pré-definido dentro das sequências LTR do pró-vírus HIV-1, resultando na excisão e erradicação do provírus de células humanas infectadas. Enquanto ainda em sua infância, dirigido a evolução molecular irá permitir a criação de enzimas personalizadas que servirão como ferramentas de cirurgia e medicina molecular molecular.

Evolução Molecular do Recombinase Tre

Atuais estratégias de HIV-1 agem para suprimir o ciclo de vida viral, mas não efetivamente erradicar a infecção. Aqui, demonstramos que uma recombinase engenharia podem eficientemente consumo DNA integrado HIV-1 proviral do genoma das células infectadas.

Entrevista: HIV-1 DNA proviral Excisão Usando um Recombinase Evolved

Aprenda a detectar Candidatus Liberibacter asiaticus em campo usando amplificação por recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a. Este método portátil oferece diagnóstico rápido e sensível para o greening dos citros.

Detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus implantável em campo usando amplificação de recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a (Vídeo) | JoVE Journal

Detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus implantável em campo usando amplificação de recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a

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