Name: Análise Fenotípica Semi-Automatizada de Culturas Funcionais de Células Esferoides 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Aprenda a cultivar esferoides 3D reproduzíveis em bioreator e caracterizá-los por proteômica LC-MS. Este método computacional permite analisar milhares de proteínas em centenas de réplicas biológicas simultâneas.

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O laboratório Sidoli agradece à Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (prêmio Sagol Network GerOmics), Deerfield (prêmio Xseed), Relay Therapeutics, Merck e ao NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

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<li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClueGO%3A+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).</li>
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</ol>

Helle Sedighi Frandsen trabalha como cientista pesquisadora na CelVivo ApS, produtora do sistema ClinoStar. Karoline Mikkelsen é uma estudante de doutorado industrial empregada na CelVivo ApS e realizando seu estudo de doutorado na SDU, Odense, Dinamarca. Todos os outros autores não têm interesses financeiros concorrentes.

A compreensão da biologia por trás das estruturas celulares tridimensionais (3D) é extremamente importante para um conhecimento mais abrangente de suas funcionalidades. Há um interesse crescente no uso de modelos 3D para estudar biologia complexa e realizar triagem de toxicidade. Ao cultivar células em 3D, muitos fatores precisam ser considerados, incluindo a avaliação fenotípica do sistema modelo. Um fenótipo é definido como um conjunto de características observáveis de um organismo específico, tais como morfologia, comportamento, propriedades fisiológicas e bioquímicas20.
Neste protocolo, demonstramos como experimentos proteômicos podem ser conduzidos a partir de alguns esferoides e podem ser usados para monitorar o fenótipo hepático típico. A espectrometria de massas tornou-se um método extensivamente aplicado para a caracterização de células 3D, permitindo a investigação de uma variedade de questões biológicas 12,16,21,22. Para uma análise abrangente do proteoma, recomenda-se o uso de pelo menos 20 μg de material de partida proteico, a partir do qual 1 μg é injetado no espectrômetro de massa. É importante mencionar que adicionar menos amostra pode levar à perda de sensibilidade, e adicionar mais pioraria gradualmente a qualidade da cromatografia e, eventualmente, levaria ao bloqueio da coluna. Neste estudo, demonstramos que os esferoides HepG2/C3A e THLE-3 são enriquecidos com proteínas importantes da glicólise e do ciclo do TCA, que são vias hepáticas específicas e são fundamentais para a manutenção dos níveis glicêmicos e para a produção de energia23,24. De fato, a análise por espectrometria de massas fornece não apenas informações em nível de proteína, mas também permite a investigação de modificações pós-traducionais de proteínas, como demonstrado anteriormente por nosso grupo16.
Outro aspecto a ser considerado em estudos fenotípicos 3D é o número e o tamanho dos esferoides. Além de tornar os experimentos mais reprodutíveis, contar o número de esferoides e determinar seu tamanho é essencial para determinar quando dividir a cultura em múltiplos biorreatores, pois o número de estruturas 3D dentro de um vaso pode afetar o tamanho dos esferoides e os níveis de atividade metabólica. No entanto, é importante ressaltar que o número e o tamanho dos esferoides dependem da linhagem celular, do número inicial de células, do processo de divisão e do tempo de coleta. Detalhes da cultura de esferoides HepG2/C3A, como número de células por esferoide, conteúdo proteico e tamanho em função da idade, foram fornecidos por Fey, Korzeniowska e Wrzesinski25. Para uma análise precisa e bem-sucedida usando o método semi-automatizado descrito aqui, o passo mais crítico é uma boa imagem dos esferoides. Para simplificar, a foto pode ser tirada com um telefone ou tablet, mas sua resolução deve ser mantida a mais alta possível. Como as imagens são de aquisição rápida, elas permitem experimentos de triagem em larga escala para visualizar características fenotípicas específicas ou investigar respostas ao tratamento medicamentoso. Portanto, devido ao crescente número de ensaios baseados em células, vários softwares de código aberto foram desenvolvidos nos últimos 10 anos para análise de imagens26. Neste protocolo, descrevemos um sistema semi-automatizado utilizando o software FIJI18 para contagem e mensuração do tamanho dos esferoides. Apresentamos scripts (comandos de programação simples) para definir uma sequência de operações algorítmicas que podem ser aplicadas a uma coleção de imagens, tornando a análise um processo fácil e rápido. No entanto, dependendo da característica do esferoide, uma medida manual deve ser empregada. Por exemplo, se os esferoides são muito translúcidos, o script FIJI será impreciso. Aliás, um dos critérios mais importantes para que esse método funcione é a compacidade dos esferoides. Essa característica contribuirá para um contraste de cores mais acentuado entre os esferoides e o fundo, o que é necessário para que o método seja preciso.
Em resumo, além de apresentar uma metodologia para o cultivo de esferoides de alta reprodutibilidade também foi descrito um sistema semi-automatizado acoplado à caracterização fenotípica via captura de imagens e proteômica. Esperamos que esta caixa de ferramentas para analisar células 3D se torne mais robusta com software de análise de imagem totalmente automatizado e espectrômetros de massa de última geração.

Culturas celulares in vitro têm se mostrado necessárias e inestimáveis no estabelecimento de conhecimentos fundamentais em biologia. Grande parte do entendimento científico em biologia e câncer especificamente veio do sistema de cultura 2D que são células crescendo em uma monocamada. Embora a cultura 2D tenha sido o sistema de cultura celular dominante, ela tem muitas desvantagens que podem potencialmente sufocar o progresso biológico. Por exemplo, culturas 2D carecem de interações célula-célula importantes para a sinalização e proliferação celular1. Até o momento, sistemas de cultura 3D têm demonstrado modelar melhor a diferenciação, a resposta a drogas, a invasão tumoral e a biologia 2,3,4,5. A modelagem 3D de cânceres malignos é especialmente vital devido ao aumento da população idosa e à mortalidade por câncer. O carcinoma hepatocelular (CHC) é uma das principais causas de mortalidade por câncer no mundo e frequentemente tem um prognóstico abismal6. Sabe-se que o CHC apresenta baixa taxa de cura, baixa resposta medicamentosa e alta taxa de recorrência 6,7,8. Vários modelos 3D para fígado normal e CHC foram desenvolvidos que mimetizam a fisiologia do tecido hepático normal e maligno in vivo9,10.
Alguns dos sistemas 3D atuais incluem sobreposições de líquidos, biorreatores, hidrogel, andaimes e estruturas impressas em 3D. Os esferoides gerados em biorreatores especificamente oferecem vantagens únicas, pois mimetizam a distribuição tumoral de exposição a nutrientes, trocas gasosas e proliferação/quiescência celular11. Os biorreatores são especialmente adequados para modelos de câncer devido à sua facilidade de uso, grande escalabilidade, difusão de nutrientes e acessibilidade11. Além disso, os biorreatores podem permitir experimentos de alto rendimento, maior reprodutibilidade e diminuição do erro humano. O biorreator utilizado neste estudo é único, pois simula um sistema de gravidade reduzida, o que minimiza as forças de cisalhamento disruptivas aplicadas em biorreatores típicos, permitindo melhor reprodutibilidade12. A gravidade omnidirecional e a redução das forças de cisalhamento permitem que as células se desenvolvam de forma mais fisiológica. Como evidência, células HepG2/C3A cultivadas sob essa metodologia desenvolvem organelas esféricas que produzem níveis in vivo de ATP, adenilato quinase, ureia e colesterol13,14. Além disso, os tratamentos medicamentosos neste sistema 3D são mais avançados e automatizados em comparação com as culturas 2D. Em culturas 2D, os tratamentos medicamentosos geralmente devem ter um curso de tempo curto devido à necessidade de tripsinizar e manter a saúde celular. No entanto, no nosso caso, podemos realizar tratamentos medicamentosos de longo prazo de esferoides sem a necessidade de interromper a estrutura e a fisiologia das células. Portanto, uma mudança de culturas 2D para 3D é necessária para melhor modelar fenômenos biológicos in vivo e maior desenvolvimento científico.
Este trabalho apresenta uma metodologia para o crescimento de esferoides de alta reprodutibilidade (Figura 1 e Figura 2) e mostra um sistema semi-automatizado para caracterizar fenotipicamente estruturas 3D (Figura 3). No nível da imagem, fornecemos informações sobre contagem e medição da área dos esferoides (Figura 3). Usando métodos de espectrometria de massas, mostramos como a proteômica pode ser usada para avaliar funções biológicas específicas (Figura 4). Ao coletar e analisar esses dados, esperamos melhorar a compreensão da biologia por trás dos sistemas de cultura de células 3D.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Seringa de</td><td>10</td> mL 2239480 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>1481754</td><td>Luer, graduada para 12 mL</td></tr><tr><td>1000 &micro; Pontas de pipeta de diâmetro largo L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Pontas de pipeta de diâmetro largo Fisher</td><td>Scientific</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>placa de filtro Orochem de 96 poços</td><td>Orochem&nbsp;</td><td>OF1100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de rodapé de 96 poços</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-FS-C</td><td></td></tr><tr><td>Coletor de vácuo de 96 poços</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Sigma</td><td>A6141-25G</td><td></td></tr><tr><td>Meio de crescimento de células epiteliais brônquicas (BEGM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau de cultura celular</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>ClinoReactor</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Biorreator para cultura de células 3D</td></tr><tr><td>Incubadora ClinoStar</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>CO2 para cultura de células 3D</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>Elplasia Placa de fixação ultrabaixa de fundo redondo de 24 poços contendo micropoços</td><td>Corning</td><td>4441</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Thermo</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank (HBSS)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Corning</td><td>354052</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora HERAcell vios 160i</td><td>Thermo</td><td>51033557</td><td>CO2 para cultura de células 2D</td></tr><tr><td>HPLC grau acetonitrila</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC grau metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC grau água</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB Resin 30 &micro; m</td><td>Waters</td><td>186007549</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Espectrômetro de massa Tribrid</td><td>Thermo</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Espectrômetro de massa de alta resolução</td></tr><tr><td>Microscópio PAULA</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Victor X2 leitor de microplacas multirótulo</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel de pH</td><td>Hydrion</td><td>93</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoetanolamina</td><td>Sigma</td><td>P0503</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfórico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A260-500</td><td></td></tr><tr><td>Pistola de pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Resina Reprosil-Pur MSWIL</td><td></td><td>R13. AQ.003</td><td>120 &Aring; tamanho dos poros, fase C18-AQ, 3 &mu; Tamanho do cordão</td></tr><tr><td>M SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610301</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina modificada de grau de sequenciamento</td><td>Concentrador a vácuo Promega</td><td>V511A</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac (placas de 96 poços)</td><td>Thermo</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Capuz estéril</td><td>Thermo</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estéreis</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>S-trap</td><td>Protifi</td><td>C02-micro-80</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de seringa (18 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14817100</td><td>3" de comprimento, 0.05" de diâmetro</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA)</td><td>Thermo</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Sigma</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>FSGPD10</tr></tbody></table>

análise fenotípica semi-automatizada de culturas funcionais de células esferoides 3d

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

Apresentamos um protocolo que descreve as propriedades e vantagens do uso de uma incubadora independente de clinostatos para cultivo, tratamento e monitoramento de culturas de células 3D. O clinostat imita um ambiente onde as células podem se reunir como esferoides altamente reprodutíveis com baixas forças de cisalhamento e difusão ativa de nutrientes. Demonstramos que hepatócitos cancerígenos e não cancerígenos (linhagens celulares HepG2/C3A e THLE-3) requerem 3 semanas de crescimento antes de atingir funcionalidades comparáveis às células hepáticas. Este protocolo destaca a conveniência de utilizar incubadoras para células 3D com câmeras monitorando o crescimento celular, pois instantâneos podem ser tirados para contar e medir esferoides após o tratamento. Descrevemos a comparação de linhagens celulares THLE-3 e HepG2/C3A, mostrando como linhagens celulares não cancerosas podem ser cultivadas, bem como células cancerosas imortalizadas. Demonstramos e ilustramos como experimentos proteômicos podem ser conduzidos a partir de alguns esferoides, que podem ser coletados sem perturbar a sinalização celular, ou seja, sem necessidade de tripsinização. Mostramos que a análise proteômica pode ser usada para monitorar o fenótipo hepático típico do metabolismo da cadeia respiratória e a produção de proteínas envolvidas na desintoxicação de metais e descrevemos um sistema semi-automatizado para contar e medir a área do esferoide. Em conjunto, o protocolo apresenta uma caixa de ferramentas que compreende uma caracterização fenotípica via captura de imagens e um pipeline proteômico para experimentação em modelos de cultura de células 3D.

Neste protocolo, descrevemos as propriedades de uma inovadora incubadora de células 3D livre de estresse, um sistema projetado especificamente para o cultivo de esferoides 3D (Figura 2). Otimizamos o protocolo para cultivo 3D de linhagens celulares THLE-3 e HepG2/C3A. O protocolo aqui descrito é simples de usar e permite a reprodutibilidade e o custo-efetivo de &gt; de 100 esferoides por biorreator. Uma vez no biorreator, os esferoides são tratados de forma semelhante às células mantidas em cultura 2D. As condições ótimas de crescimento são alcançadas trocando-se o meio duas a três vezes por semana (Figura 2B) e ajustando-se a velocidade de rotação de acordo com o crescimento e tamanho dos esferoides (Figura 2C). Este sistema, no qual esferoides 3D são cultivados em biorreatores rotativos (Figura 2E,F), fornece um ambiente de crescimento ótimo para estruturas 3D, expondo o esferoide a uma quantidade igual e muito baixa de força de cisalhamento.
Nós mostramos anteriormente como os esferoides podem ser usados para a análise da modificação da cromatina16. Aqui, demonstramos em detalhes como obter esferoides hepáticos e como experimentos proteômicos podem ser conduzidos para a análise do proteoma completo (Figura 1). Resumidamente, o protocolo foi iniciado com o uso de células planas THLE-3 ou HepG2/C3A até que a cultura atingisse 80% de confluência. Para a cultura de células como esferoides, aproximadamente 2.000 células foram plaqueadas em uma placa de ultrabaixa fixação contendo micropoços para permitir sua auto-agregação e, em seguida, os esferoides formados foram transferidos para um biorreator (Figura 1A). Apesar de estarem funcionalmente ativos após 3 semanas de cultura, como demonstrado anteriormente17, mostramos resultados de esferoides coletados após 36 dias em cultura para este protocolo. Após a coleta, os esferoides foram fiados e tanto o pellet quanto o sobrenadante foram armazenados para análise. A viabilidade celular foi avaliada a partir do sobrenadante para a quantificação da adenilato quinase liberada pelas células lesadas, conforme descrito anteriormente17. As proteínas celulares foram extraídas do pellet celular, e o proteoma total foi analisado por espectrometria de massas de alta resolução (Figura 1B).
Este protocolo também demonstra um método semi-automatizado para contagem de esferoides (Figura 3A) utilizando o programa de processamento de imagens públicas FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. Uma imagem de boa qualidade do esferoide deve ser tirada para a análise, e alguns parâmetros devem ser considerados, conforme mencionado na seção 5. Em seguida, após a preparação da imagem para análise, um script de macro (Arquivo Suplementar 1) é usado para contar os esferoides. A macro funciona primeiro fazendo uma pasta chamada contagem de esferoides FIJI, dentro da pasta onde as imagens esferoides estão localizadas. Nesta pasta, todas as informações da análise são salvas; isso inclui uma imagem dos esferoides que foram contados, com um número de identificação em cada esferoide. Ele também inclui um arquivo do Excel chamado contagem esferoide. Esse arquivo contém a área de pixel e o número de ID para cada esferoide que foi contado. Os dados correspondentes a uma figura analisada são apresentados em cada aba do arquivo. A guia é rotulada de acordo com o nome da imagem analisada. Como o tamanho do esferoide pode ser prejudicado por muitos fatores, incluindo o número de estruturas dentro de um vaso e o tratamento medicamentoso, também é importante monitorar sua área de superfície (planimetria). O roteiro macro aqui apresentado (Arquivo Suplementar 2) funciona medindo as áreas pretas, que correspondem aos esferoides da figura (Figura 3B). A saída é reunida em um arquivo chamado planimetria.xlsx, que contém a área medida, o perímetro e o diâmetro de cada esferoide. Há também uma medida chamada Feret, usada para calcular o diâmetro. Feret é o maior diâmetro possível, enquanto minFeret é o mais curto. O diâmetro é a média desses dois. Dentro da pasta de saída, além do arquivo .xlsx planimetria, há também uma imagem dos esferoides que foram medidos.
Antes de proceder à análise do proteoma, a viabilidade dos esferoides foi avaliada ao longo do tempo de cultivo. Os níveis de CA aumentam até o 17º dia, atingindo aproximadamente 7% de morte celular, e então a morte diminui para níveis abaixo de 5% (Figura 4A), o que está de acordo com trabalhos publicadosanteriormente17. Este protocolo também mostra a análise completa do proteoma para monitorar o fenótipo celular. Primeiramente, os proteomas das células planas e esferoides THLE-3 e HepG2/C3A foram comparados. Analisando o primeiro componente principal (CP1), fica evidente que há uma separação rigorosa das amostras esferoides das culturas de células planas, e parece que a correlação do tipo celular (THLE-3 e HepG2/C3A) não é relevante (Figura 4B). Embora os esferoides THLE-3 e HepG2/C3A não se agrupem, eles compartilham perfis semelhantes consistentes com a função hepática. Demonstramos neste protocolo o exemplo das metalotioneínas, que têm um papel na desintoxicação de metais realizada pelo fígado. Identificamos na análise proteômica 2 isoformas superexpressas em esferoides em comparação com células planas (MT1E e MT1X) (Figura 4C). Mostramos também o enriquecimento por Ontologia Gênica (GO) de ambas as linhagens celulares cultivadas como esferoides. O processo metabólico dos carboidratos, que compreende o ciclo do ácido tricarboxílico (ciclo do TCA), a cadeia de transporte de elétrons (respiração celular) e o metabolismo do piruvato, é um termo frequente e enriquecido tanto em esferoides HepG2/C3A quanto THLE-3 (Figura 4D,E). Desintoxicação celular, ácido graxo, e metabolismo do colesterol são outras funções enriquecidas em ambos os esferoides. Juntas, essas funções são conhecidas por serem cruciais para a função hepática.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig01.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho para cultura de esferoides e preparação de amostras . (A) Abordagem experimental de cultura de células 3D. Culturas de células planas na confluência desejada foram tripsinizadas e semeadas em uma placa de 24 poços de fixação ultrabaixa contendo micropoços, onde as células se auto-agrupam em esferoides. Após 24 h, os esferoides foram transferidos para um biorreator e cultivados até que estejam prontos para análise. (B) Após a coleta, os esferoides foram peletizados e o sobrenadante do pellet e da cultura foram armazenados até o processamento. As proteínas histonas16e não-histonas foram extraídas, digeridas em peptídeos e analisadas por espectrometria de massas de alta resolução. Arquivos brutos obtidos a partir da espectrometria de massas foram pesquisados no banco de dados humano, e os dados foram posteriormente processados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig02v2.jpg"> Figura 2: Sistema de cultura de células 3D. (A) Peças de biorreator. O biorreator é composto por uma câmara de troca gasosa e umidificação contendo esferas de água e uma câmara celular aberta com dois plugs para troca de meios e coleta de esferoides. (B) Intercâmbio de meios de biorreatores. O biorreator é preenchido com 10 mL de meio de crescimento usando uma seringa com uma agulha. (C) O aplicativo de controle do sistema. A velocidade de rotação, o nível de CO2, a temperatura, o registro de alarme e outras funcionalidades podem ser controladas usando a unidade de controle. (D) Colocação do biorreator na incubadora 3D. Cada biorreator tem um motor associado que pode girar o biorreator lentamente. (E) Biorreator em movimento com a velocidade (rpm) controlada por um comprimido (C). A velocidade (rpm) é ajustada de acordo com o tamanho dos esferoides. (F) Biorreatores dentro de incubadora 3D. A incubadora 3D pode acomodar até 6 biorreatores controlados individualmente. Foto gentilmente cedida por Jason Torres Photography. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig02largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig03.jpg"> Figura 3: Caracterização fenotípica dos esferoides via captura de imagens . (A) Contagem esferoide semi-automatizada. Depois de tirar instantâneos dos esferoides no biorreator, a imagem é preparada para análise em FIJI. Cada esferoide é contado, e um número de identificação é fornecido para cada um deles. Uma macro é usada e os resultados são exibidos mostrando o ID do esferoide contado, o rótulo (nome da imagem que foi analisada) e a área (o número de pixels contados no esferoide). (B) Determinação planimétrica da área esferoide. Usando um macro, a área, o perímetro e o diâmetro de um esferoide específico são determinados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig04.jpg"> Figura 4: Análise proteômica de esferoides hepáticos. (A) A viabilidade dos esferoides foi calculada com base na liberação de adenilato quinase (AK) no sobrenadante da cultura. Os resultados são as médias dos pontos de dados duplicados ± SD. (B) A análise de componentes principais (ACP) foi realizada para comparar o proteoma de células planas e esferoides THLE-3 e HepG2/C3A. (C) Abundância relativa de metalotioneínas, que são proteínas expressas pelo fígado humano. ±(D) Rede funcionalmente agrupada mostra enriquecimento de GO para esferoides HepG2/C3A e (E) esferoides THLE-3, onde apenas o rótulo do termo mais significativo por grupo é mostrado. A rede foi construída utilizando o ClueGo19. O tamanho do nó representa o significado do termo enriquecimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo suplementar 1: Script de macro para contagem de esferoides. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 2: Macro para determinação planimétrica de esferoides. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Apresentamos um protocolo para o cultivo de esferoides de alta reprodutibilidade e sua caracterização fenotípica usando captura de imagens e proteômica.

Análise Fenotípica Semi-Automatizada de Culturas Funcionais de Células Esferoides 3D

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Este protocolo demonstra como cultivar esferoides altamente reprodutíveis e mostra como experimentos proteômicos podem ser conduzidos para caracterizar a função biológica de estruturas 3D. Nossa cultura 3D pode produzir simultaneamente centenas de réplicas biológicas no mesmo biorreator, e a abordagem LC-MS pode medir a abundância de milhares de proteínas em um único experimento. Quem demonstrará o procedimento será Stephanie Stransky, pós-doutora do laboratório.Para começar, tome a suspensão de células HepG2/C3A e THLE-3. Contar o número de células e diluir a suspensão celular em meio de crescimento completo para obter 1 milhão de células em um volume máximo de 1,5 mililitros. Lave os poços de um acessório ultrabaixo, placa de fundo redondo de 24 poços com 0,5 mililitros de meio de crescimento e centrífuga a 3.000g por cinco minutos.Transfira a suspensão da célula para a placa e centrifuga-a por três minutos a 120g. Em seguida, incube a placa para iniciar a formação esferoide. Em seguida, equilibre o biorreator 24 horas antes de transferir os esferoides, preenchendo a câmara de umidade com 25 mililitros de água estéril e a câmara celular com nove mililitros de meio de crescimento usando uma seringa de 10 mililitros com uma agulha longa.Em seguida, coloque o biorreator em uma incubadora 3D por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Pipetar suavemente os esferoides para cima e para baixo usando pontas de furo de um mililitro de largura para desconectá-los da placa de fixação ultrabaixa e transferi-los para uma placa de cultura de tecidos. Para capturar os esferoides restantes, lave a placa com 0,5 mililitros de meio de crescimento pré-aquecido e transfira-os para a placa de cultura.Usando um microscópio de luz, avalie o tamanho, compacidade e arredondamento dos esferoides para selecionar aqueles que estão adequadamente formados. Transfira o esferoide selecionado para o biorreator de equilíbrio preenchido com cinco mililitros de meio de crescimento fresco. Em seguida, encha todo o biorreator com meios de crescimento frescos.Posicione o biorreator na incubadora 3D e ajuste a velocidade de rotação usando a unidade de controle. Substitua 10 mililitros de meios de crescimento antigos por 10 mililitros de meios frescos a cada dois ou três dias. Altere a velocidade de rotação sempre após substituir a mídia.Cultivar os esferoides por 15 dias e dividi-los entre dois biorreatores frescos. Abra o aplicativo 3D instalado no tablet, selecione o biorreator e capture a imagem. Como alternativa, coloque um fundo preto atrás do biorreator e garanta que nenhuma luz seja refletida na câmara celular.Capture a imagem o mais próximo possível do biorreator. Em seguida, colete esferoides removendo cinco mililitros de mídia do biorreator usando uma seringa presa a uma agulha longa através da porta superior. Certifique-se de que os esferoides desçam até o centro inferior do biorreator.Agora, abra a porta frontal e colete os esferoides usando uma ponta de furo de um mililitro de largura. Transfira esses esferoides para tubos de microcentrífuga, centrifuja a 500g por cinco minutos e descarte o meio. Lave o esferoide adicionando 200 microlitros de HBSS para remover o FBS.Depois disso, realizar a centrifugação a 500g por cinco minutos e descartar o sobrenadante. Em seguida, mergulhe o pellet esferoide rapidamente em nitrogênio líquido para congelá-lo e armazene esse pellet congelado a menos 80 graus Celsius até processamento adicional. Para lisar as células, pegue um tubo de esferoides coletados e ressuspenda-os em 25 microlitros de SDS 5%.Homogeneizar o pellet pipetando para cima e para baixo. Em seguida, dissolver um micrograma de amostras e 10 microlitros de ácido tricloroacético a 0,1%. Após a extração da proteína e limpeza das amostras, configurar o método de aquisição de MS para gerar os espectros de MS/MS a partir dos sinais peptídicos identificados.Em seguida, transfira a placa para o amostrador automático de cromatografia líquida de nanolitros. Defina a varredura MS completa para 300 a 1, 100 relação massa-carga no Orbitrap. Ajuste a resolução para 120000 e defina a meta de controle de ganho automático para 125.Em seguida, defina MS/MS no Orbitrap com uma janela de isolamento sequencial de 50 relação massa-carga. Aponte a meta de controle de ganho automático em 400 e defina uma energia de dissociação colisional de maior energia de 30. De acordo com a análise de viabilidade dos esferoides, os níveis de adenilato quinase aumentam até o 17º dia, resultando em cerca de 7% de morte celular.Depois, a taxa de mortalidade diminui para menos de 5%. A análise proteômica indicou que os esferoides THLE-3 e HepG2/C3A têm perfis semelhantes que refletem a função hepática. Adicionalmente, os esferoides apresentaram superexpressão de duas isoformas de metalotioneínas em relação às células planas.Redes funcionalmente agrupadas mostraram enriquecimento por ontologia gênica para o processo metabólico de carboidratos em esferas HepG2/C3A e THLE-3. Para evitar o derramamento de meios de crescimento, não abra ou feche a porta frontal quando a câmara celular estiver totalmente cheia de líquido. A preparação e análise de amostras descritas neste protocolo podem ser usadas para explorar o proteoma de cultura de células usando métodos 2D e 3D, bem como amostras de tecido.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Preparação e ensaio metabólico de 3-dimensional Spheroid co culturas de células de câncer no pâncreas e fibroblastos

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Plataforma lab-on-a-CD para geração de esferóides tridimensionais multicelulares

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Análise Fenotípica Semi-Automatizada de Culturas Funcionais de Células Esferoides 3D

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