Name: Um fluxo de trabalho baseado na web para selecionar intensificadores específicos de genes e tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T13:10:10.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a identificar intensificadores específicos de tecidos sem programação usando dados públicos de histonas e Hi-C. Este fluxo de trabalho acessível utiliza o gene TBX5 como estudo de caso para biologia cardíaca.

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<ol><li>Barral, A., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+signatures+of+enhancers+and+their+dynamic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The chromatin signatures of enhancers and their dynamic regulation.</a> Nucleus. 14 (1), 2160551(2023).</li>
<li>Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers%3A+five+essential+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancers: five essential questions.</a> Nat Rev Genet. 14 (4), 288-295 (2013).</li>
<li>Kleinjan, D. A., van Heyningen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+control+of+gene+expression%3A+emerging+mechanisms+and+disruption+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-range control of gene expression: emerging mechanisms and disruption in disease.</a> Am J Hum Genet. 76 (1), 8-32 (2005).</li>
<li>Kvon, E. Z., Waymack, R., Gad, M., Wunderlich, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+redundancy+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancer redundancy in development and disease.</a> Nat Rev Genet. 22 (5), 324-336 (2021).</li>
<li>Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+biology+and+enhanceropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhancer biology and enhanceropathies.</a> Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).</li>
<li>Sur, I., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+enhancers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of enhancers in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).</li>
<li>Panigrahi, A., O'Malley, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+enhancer+action%3A+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of enhancer action: the known and the unknown.</a> Genome Biol. 22 (1), 108(2021).</li>
<li>Bulger, M., Groudine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+mechanistic+diversity+of+distal+transcription+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers.</a> Cell. 144 (3), 327-339 (2011).</li>
<li>Krivega, I., Dean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+and+promoter+interactions-long+distance+calls%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Enhancer and promoter interactions-long distance calls.</a> Curr Opin Genet Dev. 22 (2), 79-85 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+connectivity+maps+reveal+dynamic+promoter-enhancer+long-range+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin connectivity maps reveal dynamic promoter-enhancer long-range associations.</a> Nature. 504 (7479), 306-310 (2013).</li>
<li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Res. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Thurman, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accessible+chromatin+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The accessible chromatin landscape of the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+predictive+chromatin+signatures+of+transcriptional+promoters+and+enhancers+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome.</a> Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).</li>
<li>Visel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).</li>
<li>Belton, J. -M., McCord, R. P., Gibcus, J. H., Naumova, N., Zhan, Y., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+a+comprehensive+technique+to+capture+the+conformation+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes.</a> Methods. 58 (3), 268-276 (2012).</li>
<li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+3C+technologies%3A+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes Dev. 26 (1), 11-24 (2012).</li>
<li>Gao, T., Qian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EnhancerAtlas+2.0%3A+an+updated+resource+with+enhancer+annotation+in+586+tissue%2Fcell+types+across+nine+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">EnhancerAtlas 2.0: an updated resource with enhancer annotation in 586 tissue/cell types across nine species.</a> Nucleic Acids Res. 47 (D1), D117-D123 (2019).</li>
<li>Erwin, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+diverse+datasets+improves+developmental+enhancer+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrating diverse datasets improves developmental enhancer prediction.</a> PLoS Comput Biol. 10 (6), e1003677(2014).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Spicuglia, S., Vanhille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of active enhancers.</a> Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).</li>
<li>Borsari, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers+with+tissue-specific+activity+are+enriched+in+intronic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions.</a> Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).</li>
<li>Smemo, S., Campos, L. C., Moskowitz, I. P., Krieger, J. E., Pereira, A. C., Nobrega, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+variation+in+a+TBX5+enhancer+leads+to+isolated+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulatory variation in a TBX5 enhancer leads to isolated congenital heart disease.</a> Hum Mol Genet. 21 (14), 3255-3263 (2012).</li>
<li>Boogerd, C. J., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TBX5+and+NuRD+divide+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">TBX5 and NuRD divide the heart.</a> Dev Cell. 36 (3), 242-244 (2016).</li>
<li>Dickel, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+compendium+and+functional+assessment+of+in+vivo+heart+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide compendium and functional assessment of in vivo heart enhancers.</a> Nat Commun. 7 (1), 12923(2016).</li>
<li>Pennacchio, L. A., Visel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+of+sequence+and+functional+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Limits of sequence and functional conservation.</a> Nat Genet. 42 (7), 557-558 (2010).</li>
<li>Local, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+H3K4me1-associated+proteins+at+mammalian+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers.</a> Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Visel, A., Minovitsky, S., Dubchak, I., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VISTA+Enhancer+Browser-a+database+of+tissue-specific+human+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">VISTA Enhancer Browser-a database of tissue-specific human enhancers.</a> Nucleic Acids Res. 35 (Database), D88-D92 (2007).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Estação de trabalho do computador</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Computador compatível com navegador da Web, sistema operacional Windows/Mac/Linux</td></tr><tr><td>Portal de dados 4DN</td><td>Portal de dados 4DN</td><td>https://data.4dnucleome.org/</td><td></td></tr><tr><td>Galáxia</td><td>Galáxia</td><td>https://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445</td><td></td></tr><tr><td>Github</td><td>Github</td><td>https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow</td><td></td></tr><tr><td>VISTA&nbsp;</td><td>Navegador VISTA Cardiac Enhancer</td><td>https://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/</td><td></td></tr></tbody></table>

um fluxo de trabalho baseado na web para selecionar intensificadores específicos de genes e tecidos

A Web-Based Workflow for Selecting Gene- and Tissue-Specific Enhancers

Para ilustrar o uso do protocolo apresentado, investigamos o gene TBX5 no coração humano, explorando intensificadores associados a TBX5 usando o fluxo de trabalho abrangente envolvendo dados H3K4me1, H3K27ac e Hi-C. O TBX5 é um gene que contribui para o desenvolvimento dos membros e do coração, incluindo a formação das quatro câmaras e a separação do septo24. A mutação nesse gene é uma das principais causas da síndrome de Holt-Oram (HOS), que causa anormalidades nos membros e cardiopatia congênita (DCC), incluindo defeitos septuais24. A mutação de intensificadores cardíacos associados ao TBX5 pode influenciar criticamente a DCC24. Um estudo anterior descobriu três intensificadores TBX5 conhecidos em tecido cardíaco humano específico - ou seja, "Enhancer 2", "Enhancer 9" e "Enhancer 16" (Arquivo Suplementar 2), que demonstraram ter fenótipos comparativos em camundongos transgênicos23.
Investigamos as regiões enriquecidas com H3K4me1 e H3K27ac entre RBM19 e TBX3, que são dois genes flanqueadores a jusante e a montante de TBX5 em humanos, para recuperar possíveis intensificadores no locus TBX5 (Figura 1 e Figura 2). Para identificar os intensificadores específicos do coração, as células do músculo cardíaco foram escolhidas. As regiões do potenciador cardíaco TBX5 putativas foram recuperadas como coordenadas (chr12: início-fim) e 22 regiões associadas a H3K4me1 e H3K27ac foram identificadas (Figura 3 e Arquivo Suplementar 3). Potenciadores cardíacos TBX5 putativos foram recuperados do banco de dados genômico EnsEMBL para cruzar dados Hi-C mantidos no banco de dados 4DNucleome (Figura 4). Isso foi feito para avaliar possíveis interações entre potenciais intensificadores e o promotor cardíaco TBX5 . Seguindo o protocolo aqui descrito, 21 das 22 regiões genômicas foram confirmadas para interagir com o promotor TBX5 (chr12: 114400143-114410103) nas células do músculo cardíaco (Arquivo Suplementar 4). Houve uma região que não teve interação física com o promotor (Figura 4, passo 4.8). Finalmente, comparamos este protocolo com esses intensificadores biologicamente validados e o atual banco de dados padrão-ouro de intensificadores cardíacos, VISTA Cardiac Enhancers Browser, e revelamos intensificadores adicionais não capturados atualmente pelo banco de dados25.
Realizamos uma comparação cruzada dos 21 intensificadores TBX5 recuperados pelo protocolo aqui apresentado com bancos de dados existentes. Recuperamos 4 intensificadores TBX5 do VISTA Cardiac Enhancer Browser (Arquivo Suplementar 5)25. Dos 4 intensificadores cardíacos identificados pelo VISTA, 3 intensificadores, hs2329, mm1282 e m370 se sobrepuseram às regiões identificadas por este protocolo de detecção de intensificador baseado na web (Figura 5). Cada um dos intensificadores previstos também compartilhou as regiões genômicas com intensificadores previamente validados experimentalmente de Smemo et al.23, Enhancer 2 (chr12:114025907-114026275, GRCh38) e Enhancer 16 (chr12:114415466-114420433, GRCh38), embora não tenham mostrado sobreposição com o Enhancer 9 (chr12:114263402-114266886, GRCh38). Um dos intensificadores identificados pelo VISTA, hs498 não se sobrepôs a nenhum intensificador previsto por este protocolo ou aos intensificadores validados experimentalmente de Smemo et al.23 (Figura 5), embora a região tenha mostrado sobreposição parcial com as marcas H34Kme1 (Figura 5). Da mesma forma, o Enhancer 9 não se sobrepôs aos intensificadores previstos por este pipeline, mas foi associado às marcas H3K4me1 (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig1.jpg"> 
Figura 1: Guia passo a passo para localizar o GdI no EnsEMBL Genome Browser. O utilizador abre primeiro a página inicial do EnsEMBL (1.1), seleciona a espécie (Humano) e introduz o gene na barra de pesquisa (1.2-1.3). Na lista de resultados, o ID do gene apropriado é selecionado (1.4), o que abre a página de resumo do gene. Em seguida, o usuário clica no hiperlink Região em detalhes (1.5) para visualizar a região genômica ao redor do GdI, incluindo elementos vizinhos e recursos regulatórios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig2.jpg"> 
Figura 2: Definindo a região de detecção do intensificador ao redor do GoI usando o EnsEMBL Genome Browser. Para definir a região de detecção do intensificador, identifique os dois genes vizinhos que flanqueiam o GoI usando as Anotações Básicas de Genes da trilha GENCODE , onde os genes são mostrados como blocos amarelos escuros marcados com anotações EnsEMBL / Havana mescladas. A direção transcricional de cada gene é indicada por pontas de seta (&lt; ou &gt;) ao lado do nome do gene (2.1). Para selecionar a região intergênica entre os genes vizinhos, clique e arraste pela região de interesse e escolha Ir para a região na caixa pop-up para ampliar (2.2). Para adicionar anotações regulatórias ou relacionadas ao aprimorador, clique em Adicionar/remover faixas (2.3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig3v2.jpg"> 
Figura 3: Configuração de trilhas de modificação de histonas na região de detecção do intensificador usando o EnsEMBL Genome Browser. Na barra de ferramentas à esquerda, clique em Configurar esta página (3.1) para acessar o painel de configuração da trilha e navegue até "Atividade por célula/tecido" na seção Regulamento (3.2). Na guia aberta, selecione a seção "Experimentos" (3.3) e use a barra de pesquisa Célula/Tecido para localizar e selecionar seu tecido de interesse (célula do músculo cardíaco) (3.4). No painel de marcas de histonas (3.5), habilite H3K4me1 e H3K27ac como marcas de intensificador ativas e H3K4me3 como marca promotora e clique em "Configurar exibição de faixa" (3.6). Depois de confirmar as seleções de trilhas, clique em "Exibir trilhas" (3.7) para retornar ao visualizador do genoma. Os picos das marcas de histonas são agora mostrados na região de detecção (3.8) como blocos coloridos sob o rótulo de tecido correspondente (amarelo: H3K4me1, azul: H3K27ac e laranja: H3K4me3). Pop-up "Hists &amp; Pols" contendo as coordenadas genômicas da região em pares de bases (chr:start-end), que podem ser copiados e salvos para análise downstream. Um pop-up "Hists &amp; Pols" aparece depois de clicar nos elementos coloridos da faixa. O pop-up contém as coordenadas genômicas da região em pares de bases (por exemplo, chr12:11443450-114451611 para a região promotora), que podem ser copiadas e salvas para análise downstream (3.8). Da mesma forma, para extrair intensificadores candidatos, priorize as regiões onde os picos H3K4me1 e H3K27ac se sobrepõem, conforme mostrado pelo alinhamento vertical de picos e caixas entre as trilhas (3.9). As regiões sobrepostas podem ser selecionadas diretamente clicando em suas caixas ou clicando e arrastando manualmente pelos picos alinhados para definir uma região (por exemplo, chr12:114400143-114410103 para uma região candidata ativa). As coordenadas mostradas no pop-up devem ser salvas no formato BED para validação ou visualização downstream. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig4v2.jpg"> 
Figura 4: Visualização das interações da cromatina promotor-intensificador usando mapas de calor Hi-C do 4D Nucleome Data Portal. A página inicial do Portal de Dados do 4D Nucleome exibe um gráfico de barras empilhadas resumindo os tipos de experimentos disponíveis por organismo. O conjunto de dados "Hi-C in situ " para amostras humanas é selecionado clicando na seção correspondente da barra (4.1). Uma lista filtrada de conjuntos de dados relevantes é exibida; um conjunto de dados Hi-C derivado de células H9 diferenciadas em mioblastos cardíacos é selecionado (4.2). O conjunto de dados selecionado (4.3) é aberto no navegador HiGlass por meio do botão Explorar dados (4.4). A região genômica de interesse é inserida na caixa de coordenadas (4.5) e a matriz de contato é renderizada como um mapa de calor em escala de cores. Cores mais escuras (vermelho profundo a preto) indicam frequência de contato com cromatina mais forte, enquanto cores mais claras (branco a laranja) representam interações mais fracas. Uma régua horizontal é colocada na coordenada do promotor e as réguas verticais são desenhadas nas posições de três intensificadores de controle validados experimentalmente (4.6). Essas interseções são usadas para definir um limite de interação estrito, definido pelo sinal visível mais forte (cor mais escura) entre os contatos promotor-intensificador (4.7). Regras verticais adicionais são desenhadas nos locais dos intensificadores marcados com H3K27ac e H3K4me1 candidatos (da etapa 3.8). Os candidatos cujas interseções promotor-intensificador são iguais ou mais escuras que o limite são retidos, enquanto aqueles com sinais mais fracos (quadrados de cores mais claras) são excluídos (4.8). As coordenadas retidas são extraídas manualmente e salvas no formato BED para análises posteriores. (a. Intensificador 2, b. Aprimorador 9 e c. Aprimorador 16) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig5.jpg"> 
Figura 5: Visualização do navegador genômico dos intensificadores TBX5 previstos em comparação com os intensificadores cardíacos validados pelo VISTA e os intensificadores de controle. Os instantâneos do navegador do genoma exibem o intervalo de pesquisa do intensificador (ETAPA 2) comparando os intensificadores previstos recuperados pelo protocolo baseado na web (inferior) com os intensificadores validados pelo VISTA (superior) e os intensificadores de controle validados experimentalmente (centro). O painel principal mostra o locus genômico completo com elementos reguladores anotados, incluindo picos específicos de H3K4me1 (amarelo), H3K27ac (azul) e H3K4me3 específicos do músculo cardíaco (laranja). Três figuras ampliadas capturam o alinhamento entre o recuperado pelo protocolo, o VISTA e os intensificadores de controle. A sobreposição com os intensificadores de controle é delineada com caixas vermelhas. As coordenadas para cada sub-região são exibidas nos painéis inferiores do navegador. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Dados utilizados no estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para fazer o download desta Tabela.</a>
Tabela 2: Ferramentas baseadas na Web usadas no estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Table%202.xlsx" target="_blank">Clique aqui para fazer o download desta Tabela.</a>
Arquivo Suplementar 1: Instruções de solução de problemas para o EnsEMBL Genome Browser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Clique aqui para fazer o download deste arquivo.</a>
Arquivo suplementar 2: Um arquivo BED no formato GRCh38, os intensificadores de controle cardíaco TBX5 validados experimentalmente 23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%202.bed" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 3: Um arquivo BED no formato GRCh38, intensificadores cardíacos TBX5 recuperados pelo STEP3 do EnsEMBL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%203.bed" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 4: Um arquivo BED no formato GRCh38, intensificadores cardíacos TBX5 recuperados pelo STEP4 do EnsEMBL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%204.bed" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 5: Um arquivo BED no formato GRCh38, intensificadores cardíacos TBX5 recuperados do navegador VISTA 25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%205.bed" target="_blank">Clique aqui para fazer o download deste arquivo.</a>

Um fluxo de trabalho baseado na web para selecionar intensificadores específicos de genes e tecidos

Enhancers are DNA regions that regulate gene expression. Mutations within enhancers can result in abnormal gene regulation leading to disease. Therefore, ...

a-web-based-workflow-for-selecting-gene-and-tissue-specific-enhancers

Research

JoVE Journal

Genetics

Neste trabalho, fornecemos um fluxo de trabalho experimental de como os intensificadores ativos podem ser identificados e validados experimentalmente.

Previsão e Validação de elementos reguladores de genes ativada durante ácido retinóico induzida estaminais embrionárias Diferenciação Celular

Ao contrário dos dados de sequência de DNA, epigenomic dados não são prontamente submetidos a pesquisas baseadas em texto. Aqui apresentados são os procedimentos para usar uma versão atualizada do GeNemo, uma ferramenta de Bioinformática baseado na web, para realizar pesquisas baseada em padrões para semelhanças em epigenomic dados comparando bancos de dados disponíveis on-line incluindo livre de elementos de DNA com dados do usuário.

Pesquisa baseada em padrões de dados Epigenomic usando GeNemo

Este protocolo descreve as etapas necessárias para projetar e executar a segmentação multiplexada de realçadores com a proteína de fusão desativação CASCUDO-SID4X-dCas9, também conhecido como interferência de realçador (Enhancer-i). Este protocolo permite a identificação de potenciadores que regulam a expressão gênica e facilita a dissecação das relações entre potenciadores de regulação de um gene alvo comum.

Dissecação do Enhancer função usando interferência Multiplex Enhancer CRISPR-baseado em linhas de células

Este protocolo descreve as etapas necessárias para gerar um modelo de sistema em que a transcrição de um gene endógeno de interesse pode ser condicionalmente controlada em animais vivos ou células usando reforçada ALC repressor e/ou sistemas de ativador de tet .

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

Relatamos a aplicação da captura de conformação de cromossomos quantitativos seguida de sequenciamento de alto throughput em corpos embrionários gerados a partir de células-tronco embrionárias. Esta técnica permite identificar e quantificar os contatos entre melhoradores putativos e regiões promotoras de um determinado gene durante a diferenciação de células-tronco embrionárias.

Identificação de contatos intensificadores-promotores em corpos embrionários por captura quantitativa de conformação de cromossomo (4C)

Este protocolo descreve um novo ensaio de intensificador-repórter transitório baseado em rAAV. Este ensaio pode ser usado para induzir a expressão impulsionada por potenciadores in vivo no cérebro do rato.

Implantação de AAV de construções de expressão baseadas em potenciador in vivo no cérebro do rato

Aqui, apresentamos um protocolo para a seleção in vitro de repressores transcricionais projetados (ETRs) com alta, longa duração, estável, eficiência de silenciamento no alvo e baixa atividade fora do alvo em todo o genoma. Esse fluxo de trabalho permite reduzir um repertório inicial e complexo de ETRs candidatos a uma lista curta, adequada para avaliação adicional em cenários terapeuticamente relevantes.

In vitro Seleção de Repressores Transcricionais Projetados para Silenciamento Epigenético Direcionado

A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.

Um fluxo de trabalho integrado para estudar a arquitetura do genoma espaço-temporal centrada no promotor em populações celulares escassas

Este protocolo fornece um pipeline computacional simplificado para quantificar transcritos de intensificadores nascentes. Ao integrar a acessibilidade da cromatina, a característica da cromatina e os dados transcricionais, ele permite a detecção precisa e a análise específica da atividade do intensificador em regiões intragênicas complexas, mantendo-se acessível a pesquisadores sem treinamento extensivo em bioinformática.

Um pipeline computacional para quantificação de RNA intensificador intergênico/intragênico em células-tronco embrionárias de camundongo

Descrevemos um método para classificar células individuais de mamíferos e quantificar a expressão de até 96 genes-alvo de interesse em cada célula. Este método inclui o uso de padrões internos de qPCR para permitir a estimativa de contagens absolutas de transcritos.

Unicelular perfil de expressão de genes utilizando FACS e qPCR com as Normas Internas

Aprenda a identificar intensificadores específicos de tecidos sem programação usando dados públicos de histonas e Hi-C. Este fluxo de trabalho acessível utiliza o gene TBX5 como estudo de caso para biologia cardíaca.

Um fluxo de trabalho baseado na web para selecionar intensificadores específicos de genes e tecidos

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