Name: Ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Aprenda a ablação por laser de dois fótons em osteoblastos de larvas de peixe-zebra para estudar regeneração óssea e resposta imune. Este método permite investigar mecanismos de homeostase e imunomodulação.

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O protocolo do estudo recebeu aprovação da Landesdirektion Sachsen, números de licença 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. As linhagens de peixe-zebra utilizadas foram mantidas de acordo com a legislação nacional e sob condições padronizadas, conforme descrito anteriormente27,28. Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de materiais e soluções
<ol><li>Mantenha os embriões em 1x meio E3. Prepare o meio 1x E3 diluindo 170 mL de um estoque E3 60x em 10 L de água deionizada e adicionando 2 mL de azul de metileno a 0,1%.<ol><li>Prepare o estoque de mídia E3 60x misturando 17,2 g de NaCl, 0,76 g de KCl, 2,90 g de CaCl2·2 H2O, 4,90 g de MgSO4·7 H2O em 1 L de água autoclavada deionizada.</li>
	</ol></li>
	<li>Para a inclusão das larvas, prepare alíquotas de agarose de baixo ponto de fusão (LMA) a 1% com antecedência e mantenha-as em temperatura ambiente.<ol><li>Para preparar alíquotas, dissolva a ML em 1x meio E3, por exemplo, 500 mg de LMA em 50 mL de 1x E3 em um frasco Erlenmeyer, aqueça a solução no micro-ondas até que a agarose se dissolva completamente e distribua-a em alíquotas de 1 mL em tubos de 1,5 mL.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Reprodução de peixe-zebra e coleta de embriões
NOTA: Larvas de peixe-zebra transgênicas duplas relatando a presença de osteoblastos comprometidos [osterix: nGFP = Tg (Ola.Sp7: NLS-GFP) zf132] 29 e macrófagos [mpeg: mCherry = Tg (mpeg: mCherry) gl23] foram usados aqui30 (Figura 1A).
<ol><li>Configure o peixe-zebra parental com os transgenes individuais desejados em gaiolas de acasalamento padrão na noite anterior ao acasalamento. NOTA: As gaiolas de acasalamento padrão permitem que os ovos passem para um compartimento inferior, onde o peixe-zebra parental não pode alcançá-los.<ol><li>Mantenha machos e fêmeas separados até o acasalamento usando uma divisória na gaiola de acasalamento. Remova a divisória na manhã do dia seguinte para iniciar o acasalamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Ao meio-dia, o mais tardar, remova o peixe-zebra parental dos tanques de reprodução e colete os embriões, coando a água da gaiola de acasalamento por uma peneira. NOTA: Caso a idade exata das larvas seja decisiva, colher embriões em intervalos regulares de aproximadamente 30 min. Companheiros de ninhada devem ser usados em experimentos com diferentes grupos experimentais.</li>
	<li>Colocar os embriões numa placa de 100 mm de diâmetro contendo 1 meio E3 e mantê-los numa incubadora a 28 °C31.</li>
	<li>Remova os óvulos não fertilizados e os embriões mortos do prato usando uma pipeta de plástico com a ajuda de um estereomicroscópio e troque 1x mídia E3 diariamente.</li>
	<li>Antes do experimento, classifique as larvas positivas para os transgenes repórteres usando um estereomicroscópio de fluorescência.</li>
</ol>3. Larvas incorporadas em agarose de baixo ponto de fusão
<ol><li>Derreter as alíquotas LMA num termobloco ou em banho-maria a 65 °C. Uma vez derretida a ML, mantenha-a a 42 °C até a incorporação (Figura 1B). Adicione 50 μL de 0,4% de MS-222 à alíquota de 1 mL de LMA derretida para obter uma concentração de 0,02% de MS-222 para anestesia.</li>
	<li>Anestesie 4 larvas dpf (dias após a fertilização) (ou larvas mais velhas) em meio MS-222 E3 a 0,02%.</li>
	<li>Transfira as larvas anestesiadas para uma placa de micropoços com fundo de vidro usando uma pipeta de plástico Pasteur de 3 mL e remova o excesso de meio E3 com a mesma pipeta (Figura 1B). Evite secar as larvas. NOTA: Mais de uma larva pode ser embutida em um prato simultaneamente; Recomenda-se incorporar 3 a 5 larvas para permitir tempo suficiente para a colocação.</li>
	<li>Pegue a agarose LMA derretida do banho-maria / termobloco e adicione uma gota (resfriante) de LMA ao prato, cobrindo o fundo do vidro onde as larvas foram posicionadas. Preste atenção que o LMA não está muito quente, mas ainda líquido.</li>
	<li>Em seguida, coloque as larvas na posição lateral desejada antes que a agarose se solidifique. Aqui, certifique-se de uma posição lateral na qual o opérculo esteja o mais próximo possível do fundo de vidro do prato como uma preparação para a configuração do microscópio inverso (Figura 1B).</li>
	<li>Deixe a agarose solidificar e, em seguida, adicione o meio E3 (contendo no máximo 0,02% MS-222) ao prato para evitar o ressecamento da agarose (Figura 1B).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática do procedimento de incorporação. (A) Tg(osterix:nGFP) transgênica dupla; mpeg1:mCherry)29,30 larvas de peixe-zebra com osteoblastos operculares marcados em verde e macrófagos marcados em vermelho foram usados. (B) O fluxo de trabalho do procedimento de incorporação, conforme descrito na etapa 3 do protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
4. Imagem in vivo das larvas e ablação a laser
<ol><li>Para osteoblastos de ablação a laser no opérculo em desenvolvimento de peixe-zebra transgênico Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, use um microscópio de varredura a laser invertido de dois fótons com uma objetiva de água 25x/0,95 ou uma configuração equivalente.</li>
	<li>Coloque o prato com as larvas embutidas no estágio microscópico no microscópio invertido e posicione a região desejada para ablação no centro do campo de visão. O opérculo pode ser facilmente identificado com a ajuda do sinal de fluorescência GFP.</li>
	<li>Uma vez que o opérculo esteja focado e centralizado no campo de visão do microscópio, escolha as configurações da pilha z (geralmente intervalos z de 1-2 μm são usados) para obter imagens de toda a largura do opérculo. Ao mesmo tempo, escolha a área em um plano z específico a ser ablacionado (geralmente na zona posterior do opérculo). A ablação a laser de dois fótons é exercida apenas neste plano. NOTA: Uma resolução mais alta na dimensão z levará a tempos de imagem mais longos, mas permitirá análises volumétricas dos dados adquiridos posteriormente.</li>
	<li>Imagem da área de interesse do opérculo antes da ablação. Para a detecção de GFP, use um laser de luz branca a 488 nm e um detector híbrido variando de 495 nm a 550 nm ou equivalente. Visualize os macrófagos usando excitação de 555 nm (laser de luz branca), com uma faixa de detecção mCherry de 595 a 780 nm em um detector híbrido (ou equivalente).<ol><li>Use o formato de imagem 512 x 512 para uma boa relação qualidade/tempo (outros formatos podem ser usados se desejar uma resolução mais alta ou, alternativamente, uma velocidade mais alta). NOTA: Uma incubadora com temperatura controlada instalada no microscópio pode ser usada e ajustada, por exemplo, para 28 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Desenhe uma região circular com um diâmetro de 25 μm (outras formas e tamanhos podem ser selecionados dependendo do experimento) em um plano 2D selecionado, focalizando o opérculo usando a ferramenta ROI.</li>
	<li>Para realizar a ablação, aplique a potência de ablação (medida sem objetiva) a 450 mW e exponha a área selecionada ao laser de dois fótons a uma velocidade de varredura de 400 Hz e uma duração total de 10 s. Durante a ablação, a área pode ser visualizada usando um detector híbrido na faixa de 401-443 nm ou equivalente.</li>
	<li>Após a ablação, confirme a ablação estruturalmente criando imagens novamente da mesma pilha z com as mesmas configurações usadas antes da ablação. A área de ablação não contém mais células fluorescentes.</li>
</ol>5. Recuperação de larvas e imagens para monitorar o recrutamento de células imunes
<ol><li>Se a imagem do recrutamento de células imunes precisar ser realizada com atraso, recupere as larvas da imagem e da anestesia. Remova as larvas cuidadosamente da ML usando uma pinça ou uma agulha de dissecção.<ol><li>Primeiro, remova uma camada de agarose que cobre as larvas. Em segundo lugar, remova a agarose em contato direto com as larvas. Omita esta etapa se a imagem imediata do recrutamento de células imunes estiver ocorrendo.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque as larvas de volta em um prato com meio E3 puro e verifique sua recuperação. A recuperação é evidente pela natação das larvas.</li>
	<li>Aos 4 ou 6 hpl (horas após a lesão), imagine a área do opérculo novamente usando as mesmas configurações no mesmo microscópio para verificar os efeitos da ablação no recrutamento de macrófagos. Para fazer isso, repita a incorporação (etapa 3) e a imagem como realizada anteriormente (etapa 4).</li>
	<li>Após a imagem, remova as larvas da ML. O sacrifício das larvas pode ser realizado por incubação em água gelada ou com uma overdose de MS-222 em E3, dependendo dos requisitos legais. As amostras podem então ser usadas para estudos de acompanhamento ou descartadas.</li>
</ol>6. Análise de imagem e análise estatística
<ol><li>Processe as imagens usando um software de processamento de imagem, como o Fiji32. Dependendo da resolução z dos dados adquiridos, as análises podem ser realizadas em 2D ou 3D.</li>
	<li>Quantifique os macrófagos manualmente, incluindo células claramente separadas, por exemplo, discernindo os principais corpos celulares ou, alternativamente, quantificando as células com um rótulo nuclear ou medindo a área caso as células estejam sobrepostas (próximo passo).</li>
	<li>Para quantificação da área, crie uma máscara abrangendo os macrófagos. Para fazer isso, use a ferramenta Ajustar &gt; Limite do &gt; Imagem e crie um ROI (Analisar Ferramentas &gt; &gt; Gerenciador de ROI &gt; Adicionar) em Fiji. Exclua pequenas partículas no fundo para quantificação.<ol><li>Em seguida, meça a área (Analisar &gt; Medir). Considere se as áreas de fluorescência celular sobreposta precisam ser incluídas na medição. NOTA: Aqui, a área de ablação circular foi omitida das medidas de área, uma vez que os macrófagos recrutados não podem ser distinguidos nesta área.</li>
	</ol></li>
	<li>Gere gráficos traçando os resultados da medição usando um software adequado. Para comparar os dados antes e depois da ablação, realize um teste estatístico apropriado (aqui, um teste t unicaudal pareado foi realizado). NOTA: As figuras podem ser preparadas usando software de edição de fotos e design gráfico.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Método de ablação a laser para estudar a regeneração óssea em larvas de peixe-zebra

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<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li>
<li>Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+combines+with+planar+polarised+patterning+during+metaphase+to+orient+embryonic+epithelial+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions.</a> Dev. 151 (10), dev202862(2024).</li>
<li>Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+complexity+of+cell+death%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Diversity and complexity of cell death: A historical review.</a> Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).</li>
<li>O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zones+of+cellular+damage+around+pulsed-laser+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds.</a> PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).</li>
<li>Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+clearance+of+damaged+tissue+following+laser+ablation+in+engineered+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues.</a> APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).</li>
<li>Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado, CaCl2&middot; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células, PS, 100/20 mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Foceps</td><td>FST</td><td>11295-51</td><td>Forma da ponta reta, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm</td></tr><tr><td>Placa Falcon de 6 poços</td><td>Corning</td><td>353502</td><td></td></tr><tr><td>Placa de micropoços com fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Prato de 35 mm, Nº 1.5 Lamínula, Diâmetro de Vidro de 14 mm, Não Revestido</td></tr><tr><td>Laser multifotônico Insight X3</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite</td><td>LAS X, Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baixo ponto de fusão de agarose&nbsp;</td><td>Biozyme</td><td>840101</td><td>Biozym Plaque Agarose</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Gaiolas</td><td></td><td></td> de acoplamento <td>muitas variedades, por exemplo, Tecniplast</td></tr><tr><td>Methyleneblue</td><td>Carl Roth</td><td>A514.1</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio, KCl</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131494</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio, NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>SP8 FALCON&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Equipado com um laser multifotônico Insight X3 e software Leica Application Suite</td></tr><tr><td>Agulha de dissecação de aço inoxidável</td><td>Bochem</td><td>12010</td> Sistema de microscópio estéreo de <td>140 mm</td></tr><tr><td>SZX16</td><td>Olympus</td><td></td><td>Equipado com uma base de iluminação LED SZX2-ILLTQ</td></tr><tr><td>Gabinetes termostáticos TS - WTW</td><td>xilema</td><td>TS 608/2-i</td><td>Para incubação (embrião)</td></tr><tr><td>Transferência pipeta, 3,5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>861171</td><td>155 x 15 mm, LD-PE, transparente</td></tr><tr><td>Zeiss SteREO Discovery.V12 versão 4.7.1.0.</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Equipado com câmera Axiocam MRm e software AxioVision</td></tr></tbody></table>

ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

A ablação a laser foi realizada conforme indicado no protocolo acima. O sinal GFP dos osteoblastos na área ablacionada desapareceu instantaneamente após a ablação. Para estudar a resposta da ablação de osteoblastos em termos de resposta imune, foi observada a presença de macrófagos em larvas de 6 dpf antes e em 6 hpl. Antes da ablação, muito poucos macrófagos foram observados na área do opérculo10 (Figura 2). Aos 6 hpl, foi detectado um forte acúmulo de macrófagos na região do opérculo ablacionado e um aumento do número de macrófagos no campo de visão, incluindo o opérculo e a área ao redor do opérculo10 (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig02v2.jpg"> Figura 2: Recrutamento de macrófagos a 6 hpl em larvas de peixe-zebra de 6 dpf. Área do opérculo sem ablação e a 6 hpl. Os osteoblastos operculares são marcados em verde, os macrófagos em magenta e o círculo tracejado indica a área de ablação a laser. Barra de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
O recrutamento de macrófagos também foi analisado em larvas de 4 dpf com opérculos muito menores em 4 hpl observando resultados semelhantes (Figura 3). A quantificação do número de macrófagos (fora do local de ablação imediata a laser) mostrou um aumento dentro do período de tempo investigado (4,00 ± 2,37 macrófagos antes da ablação versus 7,00 ± 2,76 macrófagos a 4 hpl) (Figura 3B). Da mesma forma, a área de macrófagos (medida em μm2, 785,8 μm2 ± 723,1 μm2 antes da ablação versus 1553 μm2 ± 869,9 μm2 a 4 hpl) aumentou ( Figura 3C ). Como os macrófagos às vezes são difíceis de distinguir, recomenda-se medir a área dos macrófagos em vez do número de macrófagos, como foi feito aqui.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig03.jpg"> Figura 3: Recrutamento de macrófagos a 4 hpl em larvas de peixe-zebra de 4 dpf. (A) Área do opérculo sem ablação e a 4 hpl. Os osteoblastos operculares são marcados em verde, os macrófagos em magenta e o círculo tracejado indica a área de ablação a laser. Barra de escala: 50 μm. (B) Quantificação do número de macrófagos na área do opérculo diretamente antes (0 hpl) e após a ablação (4 hpl). (C) Quantificação da área de macrófagos (local de ablação a laser excluído). Testes t unicaudais pareados. Cada ponto representa os dados de uma larva, e a média ± DP é mostrada, n = 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

two-photon-laser-mediated-ablation-osteoblasts-developing-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Aqui nós descrevemos um método para a montagem de embriões zebrafish de longo prazo de imagem, de dois fótons de imagem e tecidos de danos técnicas e lapso de tempo de imagem confocal.

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Lesão renal aguda (IRA) em seres humanos é um problema clínico comum causado por danos às células epiteliais que compõem néfrons nos rins, e AKI está associada com altas taxas de mortalidade de 50-70% 1. Após a destruição das células epiteliais, néfrons têm uma capacidade limitada de regeneração, embora os mecanismos e as limitações que orientam este fenômeno ainda são pouco compreendidas. Neste artigo de vídeo, descrevemos nossa técnica de ablação a laser alvo de células renais dos néfrons nos...

Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

O método aqui apresentado compreende a lesão precisa de embriões vivos zebrafish com pulsos de laser de alta potência e a subsequente análise das lesões e sua recuperação com o tempo. Também mostramos como geneticamente marcado individual ou grupos de células do músculo esquelético pode ser monitorado durante e após o laser danos leves induzido.

Laser-infligido Lesão de Zebrafish muscular esquelético embrionário

Este vídeo descreve o método para ferir axônios em embriões de peixe-zebra usando axotomia a laser de dois fótons e observando a recuperação axonal de lesões.

Axotomia a laser de dois fótons: um método para ferir axônios em embriões de peixe-zebra e observar a recuperação axonal

Source: Morsch, M.,  et. al., Triggering Cell Stress and Death Using UV Laser Confocal Microscopia Convencional. J. Vis. Exp. (2017) Neste vídeo, exploramos a técnica de ablação a laser UV de alta intensidade para direcionar e estudar com precisão neurônios individuais em peixes-zebra transgênicos. Demonstramos como preparar, imobilizar e visualizar respostas neuronais, destacando a dinâmica celular da lesão e recuperação.

Ablação seletiva a laser de neurônio único em uma larva de peixe-zebra usando um microscópio confocal

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57485/ ablação-neuronal-população-usando-dois-fótons-laser-sua-avaliação'&gt;Muto, A., et al. Ablação de uma população neuronal usando um laser de dois fótons e sua avaliação usando imagens de cálcio e registro comportamental em larvas de peixe-zebra. J. Vis. exp. (2018) Neste vídeo, é demonstrado um procedimento de ablação a laser de dois fótons, permitindo a destruição seletiva de neurônios fluorescentes em larvas de...

Ablação neuronal direcionada usando microscopia de dois fótons em uma larava de peixe-zebra

Aqui, apresentamos um protocolo para ablate uma subpopulação geneticamente rotulada de neurônios por um laser de dois fotões de larvas de peixe-zebra.

Ablação de uma população Neuronal, usando um Laser de dois fotões e sua avaliação usando imagens de cálcio e gravação comportamental em larvas de Zebrafish

A ablação a laser é uma tecnologia amplamente aplicável para estudar a regeneração em sistemas biológicos. O protocolo apresentado descreve o uso de um microscópio confocal padrão de varredura a laser para ablação a laser e imagens subsequentes de lapso de tempo de células interneuromast regeneradoras na linha lateral do zebrafish.

Ablação e Regeneração a laser baseada em microscópio confocal em células interneuromast baseadas em zebrafish

O desenvolvimento embrionário requer coordenação em larga escala do movimento celular. A ablação a laser mediada por dois fótons permite a ablação espacialmente controlada em três dimensões de grandes grupos de células profundas. Além disso, essa técnica pode sondar a reação de células migratórias coletivamente in vivo a perturbações em seu ambiente mecânico.

Ablações de volume profunda e espacialmente controladas usando um microscópio de dois fótons no Gás de Peixe-Zebra

Apresentamos um protocolo para capturar a dinâmica da regeneração da barbatana caudal de larvas de peixe-zebra em uma escala de tecido inteiro usando estereomicroscopia baseada em campo claro. Esta técnica permite capturar a dinâmica de regeneração com resolução de célula única. Esta metodologia pode ser adaptada a qualquer estereomicroscópio equipado com uma câmera CCD e software de lapso de tempo.

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

Aprenda a ablação por laser de dois fótons em osteoblastos de larvas de peixe-zebra para estudar regeneração óssea e resposta imune. Este método permite investigar mecanismos de homeostase e imunomodulação.

Ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento

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