Name: Projetos microfluídicos de laminação de tereftalato de polietileno de baixo custo para imagens multiplexadas de peixe-zebra (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Aprenda a fabricar dispositivos microfluídicos de baixo custo com laminação de PET para imagens multiplexadas de embriões de peixe-zebra. Este método permite estudar sinais que coordenam inflamação e cicatrização de feridas em biologia do desenvolvimento.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Lamínula redonda de 25 mm de diâmetro #1 espessura</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1760-025</td><td>Material de montagem base. A espessura foi escolhida com base nas especificações da lente do microscópio.</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator v28.5</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>Editor vetorial para projetar o padrão do dispositivo.</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td>Para fazer E3 médio.</td></tr><tr><td>Projetar arquivos PNG (Online Mirror)</td><td>N/A</td><td>N/A</td> https://i.ibb.co/QPYj7BL/multipositionalv7-1.png<<td>br/> https://i.ibb.co/FDpQYXc/multipositionalv7-2.png https://i.ibb.co/5TG4SB6/multipositionalv7-3.png</td></tr><tr><td>Espaço de design para desktop v8.39</td><td>Cricut</td><td>N/A</td><td>Software proprietário para acionar o cortador artesanal.</td></tr><tr><td>Fusion Plus 7000L</td><td>GBC</td><td>1703098</td><td>laminador térmico. Este modelo específico foi selecionado para recursos de qualidade de vida, como tamanho máximo da pilha de folhas.</td></tr><tr><td>Lâmina Premium de Carboneto Alemão</td><td>Cricut</td><td>10396595</td><td>Lâmina de substituição para cortador de artesanato.</td></tr><tr><td>Conjunto de ferramentas básicas cinza</td><td>Cricut</td><td>10307854</td><td>Conjunto de ferramentas para cortes de capina, limpeza de tapetes e montagem de folhas de PET. Opcional.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexa-hidratado</td><td>Acros 223211000 orgânico</td><td></td><td>Para fazer E3 meio.</td></tr><tr><td>Maker 3</td><td>Cricut</td><td>10669040</td><td>cortador de artesanato. O Cricut Maker 3 foi selecionado em vez do Silhouette Cameo 4 pela facilidade de uso do software, mas qualquer cortador de artesanato capaz de ler imagens em preto e branco funcionará.</td></tr><tr><td>MemGlow 560</td><td>Citoesqueleto</td><td>MG02-10</td><td>Corante de células vivas vermelhas para membranas celulares. Não é necessário lavar. Usado na Figura 3.&nbsp;</td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi de carbono nº 22</td><td>Design cirúrgico<</td><td>br/> 22-079-697</td><td>Lâmina de bisturi para ajustes manuais de corte. Qualquer faca artesanal semelhante (por exemplo, faca X-acto # 2) também funcionará.</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher</td><td>BP366</td><td>Para fazer o meio E3.</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>Para fazer E3 médio.</td></tr><tr><td>Tapete de corte adesivo StandardGrip</td><td>Cricut</td><td>10138842</td><td>Tapete de montagem para cortador de artesanato. A esteira de corte LightGrip também funcionará, mas evite as esteiras de corte StrongGrip e FabricGrip, pois a resistência do adesivo pode deformar o corte final durante a remoção e remoção de ervas daninhas. O adesivo nos tapetes acabará se desgastando com o uso contínuo; Substitua os tapetes conforme necessário.</td></tr><tr><td>Fita de papelaria 12 mm</td><td>Deli</td><td>30014</td><td>Fita de escritório. A marca Deli foi escolhida por meio de testes para facilitar a remoção após a laminação.</td></tr><tr><td>Super cola, cola líquida</td><td>de Loctite</td><td>1364076</td><td>Cianoacrilato. <forte>A cola usada deve ser líquida.</forte> As formulações de gel não vedam suficientemente ou impermeabilizam as bordas do dispositivo.</td></tr><tr><td>Bolsas de Laminação Térmica PET,</td> folhas <td>de PET Scotch</td><td>TP3854</td> de 3 mil <td>com adesivo térmico. As folhas chegam como pares imprensados e devem ser separadas antes do uso. Corte com o lado adesivo voltado para baixo.</td></tr><tr><td>Bolsas de Laminação Térmica PET,</td> folhas de PET <td>Scotch</td><td>TP5854</td> de 5 mil <td>com adesivo térmico. As folhas chegam como pares imprensados e devem ser separadas antes do uso. Corte com o lado adesivo voltado para baixo.</td></tr><tr><td>Tricocaína (MS-222)</td><td>Anestésico</td> <td>Syndel</td><td>IC10310680</td> Fish.</tr></tbody></table>

projetos microfluídicos de laminação de tereftalato de polietileno de baixo custo para imagens multiplexadas de peixe-zebra

Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics Designs for Multiplexed Zebrafish Imaging

Para comparação da qualidade da imagem produzida por um confocal de varredura a laser com e sem o auxílio do RADISH, os embriões que expressam o biossensor intensiométrico de cálcio GCaMP6f22,24 na camada epitelial externa foram corados usando MemGlow 560 e fotografados com um confocal de varredura a laser invertido cobrindo toda a espessura da dobra da barbatana caudal em um intervalo de tempo de 1 min por quadro (Vídeo 2). Sem o dispositivo (Figura 3A), as amostras se desviaram significativamente e exibiram artefatos de bandas, resultantes da limitação da pilha Z a 25 fatias para caber na resolução temporal especificada em comparação com a imagem com o dispositivo (Figura 3B). O RADISH foi ainda usado para examinar transientes de cálcio imediatamente após a ferida em embriões que expressam Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt1821, destacando a E-caderina endógena em vermelho e cálcio citoplasmático no epitélio apical em verde. Os embriões foram feridos paralelamente aos lados da câmara central usando uma lâmina de bisturi (Figura 4A e Vídeo 3) ou por ablação direta a laser com um laser IR (Figura 4B), depois fotografados através de toda a espessura da dobra da barbatana caudal. 
Para demonstrar a eficácia do RADISH para imagens de longo prazo, investigamos o recrutamento de células imunes para a borda da ferida por 24 horas após a ferida. Quatro embriões de peixe-zebra a 3 dpf expressando Tol2 (mpx: Dendra2) para marcar neutrófilos em verde23 foram feridos por transecção da cauda e fotografados por 24 horas consecutivas (Figura 5). Artefatos de imagem tipicamente associados a embriões tardios de 3 dpf a 4 dpf, como inclinação e flutuação, estavam notavelmente ausentes (Vídeo 4), e o crescimento do tecido continuou desimpedido para o experimento. O recrutamento de neutrófilos para a borda da ferida continua ao longo da imagem (Figura 5B), com a maioria das células migratórias saindo 24 h após a ferida (Figura 5C), consistente com a resolução esperada da inflamação25,26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig01.jpg"> 
Figura 1: Projeto e uso do dispositivo microfluídico laminado PET (RADISH). (A) Esquema ilustrando o arranjo e a espessura das camadas individuais de PET, montagem e montagem e uso do dispositivo. (B) Produto final, montado em um recorte de 3/4" em um prato de 35 mm. (C) 3 embriões dpf, (D) 5 embriões dpf, (E) 14 embriões dpf alojados dentro do dispositivo. Barras de escala = 1.000 μm (C,D,E). Abreviaturas: PET = tereftalato de polietileno; RADISH = Assistente rotacional para imagens Danio de cicatrização subsequente; DPF = dias após a fertilização. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig02.jpg"> 
Figura 2: Ilustração fotográfica passo a passo da montagem do dispositivo PET. (A) Camadas individuais de PET antes da laminação. (B) Camada de PET presa a lamínula de 25 mm usando fita adesiva. (C) Dispositivo em andamento preso a um suporte de plástico para laminação. (D) Dispositivo laminado PET completo. (E) Prato de 35 mm modificado antes da montagem do dispositivo. (F) Dispositivo completo. Abreviatura: PET = tereftalato de polietileno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig03.jpg"> 
Figura 3: Melhor qualidade das imagens confocais de varredura a laser de embriões de 3 dpf no projeto RADISH. (A) Imagem representativa de embrião Tg de 3 dpf (krt4: Gal4, UAS: GCaMP6f) corado com MemGlow 560 sem usar o RADISH. (B) Imagem representativa do embrião Tg (krt4: Gal4, UAS: GCaMP6f) corado com MemGlow 560 montado no RADISH. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: RADISH = Assistente rotacional para Danio Imaging of Subsequent Healing; DPF = dias após a fertilização. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig04.jpg"> 
Figura 4: Compatibilidade do desenho RADISH com múltiplas técnicas de ferimento. (A) 3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 embrião ferido por transecção manual da cauda. (B) Embrião ferido por ablação a laser. (C, D) Os mesmos embriões 4 min depois, mostrando a progressão dos transientes de cálcio após a ferida. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: RADISH = Assistente rotacional para Danio Imaging of Subsequent Healing; DPF = dias após a fertilização. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig05.jpg"> 
Figura 5: Aprisionamento de longo prazo de embriões para imagens da migração de fagócitos. (A) Embriões Tol2 (mpx: Dendra2) imediatamente após o ferimento, e os mesmos embriões (B) 25 min, (C) 12 h e (D) 24 h depois. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo suplementar 1: Arquivos vetoriais e PNG para design de dispositivo RADISH, conforme mostrado na Figura 1A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313_Supp%20File%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Vídeo 1: Vídeo de campo claro da transecção manual da barbatana caudal usando o design do dispositivo RADISH. Abreviatura: RADISH = Assistente rotacional para imagens Danio de cicatrização subsequente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%201.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 2: Comparação de embriões Tg (krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) não montados versus 3 dpf montados da Figura 3, adquiridos a 1 quadro/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%202.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 3: Transientes de cálcio em embriões Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 feridos por transecção de bisturi ou ablação a laser da Figura 4, adquiridos a 1 quadro/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%203.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 4: Imagem de longo prazo do recrutamento de leucócitos e regeneração da barbatana caudal em embriões Tol2 (mpx: Dendra2). Abreviaturas: RADISH = Assistente rotacional para Danio Imaging of Subsequent Healing; hpw = horas após o ferimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%204.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>

Projetos microfluídicos de laminação de tereftalato de polietileno de baixo custo para imagens multiplexadas de peixe-zebra

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Research

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O desenvolvimento do peixe-zebra pode ser seguido ao longo de dias com microscopia folha de luz quando os embriões estão embutidos em tubos de polímero opticamente clara com agarose de baixa concentração.

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Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Este manuscrito descreve o zWEDGI (zebrafish Wounding e dispositivo de uma armadilha para o crescimento e a geração de imagens), que é um dispositivo compartimentado, projetado para orientar e restringir as larvas zebrafish. O projeto permite a transecção de cauda e a longo prazo coleção de imagens de alta resolução de microscopia fluorescente de cicatrização e regeneração.

A longo prazo dispositivo de imagens ao vivo para melhor manipulação Experimental de larvas de Zebrafish

Microinjeção de zebrafish embriões e larvas é uma técnica crucial mas desafiador, usada em muitos modelos de zebrafish. Aqui, apresentamos uma gama de ferramentas de microescala para auxiliar na estabilização e orientação do zebrafish para microinjeção e a imagem latente.

Microstructured dispositivos para Microinjection otimizado e imagem latente de larvas de Zebrafish

Aqui apresentamos um protocolo para projetar e fabricar dispositivos microfluídicos personalizados com o mínimo de investimento financeiro e de tempo. O objetivo é facilitar a adoção de tecnologias microfluídicas em laboratórios de pesquisa biomédica e ambientes educacionais.

Fabricação rápida de dispositivos microfluídicos personalizados para pesquisa e aplicações educacionais

Este artigo descreve um método para montar embriões frágeis do zebrafish para a microscopia confocal prolongada do tempo-lapso. Este método de baixo custo é fácil de executar usando pratos regulares de microscopia com fundo de vidro para imagens em qualquer microscópio invertido. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Descrevemos ferramentas otimizadas para estudar o coração de zebrafish in vivo com microscopia de fluorescência de folha de luz. Especificamente, sugerimos linhas transgênicas cardíacas brilhantes e apresentamos novas técnicas de incorporação e imobilização suaves que evitam defeitos de desenvolvimento e coração. Um possível pipeline de aquisição e análise de dados adaptado à imagem cardíaca também é fornecido.

Microscopia de Folha de Luz da Dinâmica Cardíaca Rápida em Embriões de Zebrafish

Este protocolo utiliza imagens de lâminas de luz para investigar a função contrátil cardíaca em larvas de peixe-zebra e obter informações sobre mecânica cardíaca por meio de rastreamento celular e análise interativa.

Imagem de folha de luz 4D da contração cardíaca do peixe-zebra

Uma estratégia de preparação de amostras para imagens de embriões iniciais de peixe-zebra dentro de um córion intacto usando um microscópio de folha de luz é descrita. Ele analisa as diferentes orientações que os embriões adquirem dentro do córion nos estágios de 70% de epibólia e gema e detalha estratégias de imagem para obter resolução em escala celular em todo o embrião usando o sistema de folha de luz.

Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra

Aprenda a fabricar dispositivos microfluídicos de baixo custo com laminação de PET para imagens multiplexadas de embriões de peixe-zebra. Este método permite estudar sinais que coordenam inflamação e cicatrização de feridas em biologia do desenvolvimento.

Projetos microfluídicos de laminação de tereftalato de polietileno de baixo custo para imagens multiplexadas de peixe-zebra

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