Name: Nocaute de gene mediado por CRISPR-Cas9 baseado em eletroporação em células THP-1 e isolamento de clone de célula única (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda a editar genes em células THP-1 usando CRISPR-Cas9 e eletroporação para estudar resistência ao HIV. Este protocolo permite isolar clones de célula única e investigar o papel da enzima HT-1 na replicação viral.

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<ol><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Danis, V. A., Millington, M., Hyland, V. J., Grennan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+production+by+normal+human+monocytes%3A+inter-subject+variation+and+relationship+to+an+IL-1+receptor+antagonist+%28IL-lRa%29+gene+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokine production by normal human monocytes: inter-subject variation and relationship to an IL-1 receptor antagonist (IL-lRa) gene polymorphism.</a> Clin Exp Immunol. 99, https://academic.oup.com/cei/article/99/2/303/6484286 (1995).</li>
<li>Bol, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+variation+in+in+vitro+HIV-1+susceptibility+of+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Donor variation in in vitro HIV-1 susceptibility of monocyte-derived macrophages.</a> Virology. 390 (2), 205-211 (2009).</li>
<li>Appleby, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+heterogeneity+in+human+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Sources of heterogeneity in human monocyte subsets.</a> Immunol Lett. 152 (1), 32-41 (2013).</li>
<li>O'Neill, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+bulk+RNA-sequencing+reveal+differences+in+monocyte+susceptibility+to+Influenza+A+virus+infection+between+Africans+and+Europeans%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell and bulk RNA-sequencing reveal differences in monocyte susceptibility to Influenza A virus infection between Africans and Europeans.</a> Front Immunol. 12, 768189(2021).</li>
<li>Wen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparability+study+of+monocyte-derived+dendritic+cells%2C+primary+monocytes%2C+and+THP1+cells+for+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparability study of monocyte-derived dendritic cells, primary monocytes, and THP1 cells for innate immune responses.</a> J Immunol Methods. 498, 113147(2021).</li>
<li>Inagaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-g-induced+apoptosis+and+activation+of+THP-1+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Interferon-g-induced apoptosis and activation of THP-1 macrophages.</a> Life Sci. 71 (21), 2499-2508 (2002).</li>
<li>Boonkaewwan, C., Toskulkao, C., Vongsakul, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+immunomodulatory+activities+of+stevioside+and+its+metabolite+steviol+on+THP-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and immunomodulatory activities of stevioside and its metabolite steviol on THP-1 cells.</a> J Agric Food Chem. 54 (3), 785-789 (2006).</li>
<li>Chanput, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Glucans+are+involved+in+immune-modulation+of+THP-1+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">β-Glucans are involved in immune-modulation of THP-1 macrophages.</a> Mol Nutr Food Res. 56 (5), 822-833 (2012).</li>
<li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP3+inhibits+type+I+interferon+signaling+by+deubiquitinating+RIG-I-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">USP3 inhibits type I interferon signaling by deubiquitinating RIG-I-like receptors.</a> Cell Res. 24 (4), 400-416 (2014).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+suppresses+innate+immune+responses+to+viral+infections+and+inflammatory+stimuli+by+inhibiting+the+NF-%CE%BAB+and+interferon+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 suppresses innate immune responses to viral infections and inflammatory stimuli by inhibiting the NF-κB and interferon pathways.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (16), E3798-E3807 (2018).</li>
<li>Pradhananga, S., Spalinskas, R., Poujade, F. A., Eriksson, P., Sahlén, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+anchored+interaction+landscape+of+THP-1+macrophages+captures+early+immune+response+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promoter anchored interaction landscape of THP-1 macrophages captures early immune response processes.</a> Cell Immunol. 355, 104148(2020).</li>
<li>Mezzasoma, L., Talesa, V. N., Romani, R., Bellezza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anp+and+BNP+exert+anti-inflammatory+action+via+npr-1%2Fcgmp+axis+by+interfering+with+canonical%2C+non-canonical%2C+and+alternative+routes+of+inflammasome+activation+in+human+THP1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Anp and BNP exert anti-inflammatory action via npr-1/cgmp axis by interfering with canonical, non-canonical, and alternative routes of inflammasome activation in human THP1 cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (1), 1-17 (2021).</li>
<li>Martinat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+SAMHD1+at+Lysine+595+is+required+for+HIV-1+restriction+in+non-cycling+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of SAMHD1 at Lysine 595 is required for HIV-1 restriction in non-cycling cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 4582(2021).</li>
<li>Rensen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+and+reverse+transcription+of+HIV-1+genomes+in+nuclear+niches+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Clustering and reverse transcription of HIV-1 genomes in nuclear niches of macrophages.</a> EMBO J. 40 (1), e105247(2021).</li>
<li>Ikeda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APOBEC3+degradation+is+the+primary+function+of+HIV-1+Vif+determining+virion+infectivity+in+the+myeloid+cell+line+THP-1%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">APOBEC3 degradation is the primary function of HIV-1 Vif determining virion infectivity in the myeloid cell line THP-1.</a> mBio. 14 (4), e0078223(2023).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual+RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li>
<li>Kurosaki, T., Maquat, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense-mediated+mRNA+decay+in+humans+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Nonsense-mediated mRNA decay in humans at a glance.</a> J Cell Sci. 129 (3), 461-467 (2016).</li>
<li>Tuladhar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-based+mutagenesis+frequently+provokes+on-target+mRNA+misregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-based mutagenesis frequently provokes on-target mRNA misregulation.</a> Nat Commun. 10 (1), 4056(2019).</li>
<li>Embree, C. M., Abu-Alhasan, R., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+factors+that+dictate+if+terminating+ribosomes+cause+or+counteract+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Features and factors that dictate if terminating ribosomes cause or counteract nonsense-mediated mRNA decay.</a> J Biol Chem. 298 (11), 102592(2022).</li>
<li>Xue, C., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathway+choices+in+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing.</a> Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).</li>
<li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high+transfection+efficiency+in+THP-1+suspension+cells+without+PMA+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A method for high transfection efficiency in THP-1 suspension cells without PMA treatment.</a> Anal Biochem. 544, 93-97 (2018).</li>
<li>Ji, W., Zhang, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+using+lentivirus+to+establish+THP-1+suspension+cell+lines+for+immunostaining+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol using lentivirus to establish THP-1 suspension cell lines for immunostaining and confocal microscopy.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102032(2023).</li>
<li>Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, (2023).</li>
<li>Synthego Performance Analysis, ICE Analysis. 3.0, Synthego. 
 <a target="_blank" href="https://www.synthego.com/help/citing-ice">https://www.synthego.com/help/citing-ice</a> (2019).</li>
<li>Salamov, A. A., Nishikawa, T., Swindells, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+protein+coding+region+integrity+in+cDNA+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Assessing protein coding region integrity in cDNA sequencing projects.</a> Bioinformatics. 14, 384-390 (1998).</li>
<li>Pedersen, A. G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+network+prediction+of+translation+initiation+sites+in+eukaryotes%3A+Perspectives+for+EST+and+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Int+Conf+Intell+Syst+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural network prediction of translation initiation sites in eukaryotes: Perspectives for EST and genome analysis.</a> Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol. 5, 226-233 (1997).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Res. 46 (W1), W242-W245 (2018).</li>
<li>Laguette, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMHD1+is+the+dendritic-+and+myeloid-cell-specific+HIV-1+restriction+factor+counteracted+by+Vpx%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SAMHD1 is the dendritic- and myeloid-cell-specific HIV-1 restriction factor counteracted by Vpx.</a> Nature. 474 (7353), 654-657 (2011).</li>
<li>Hrecka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vpx+relieves+inhibition+of+HIV-1+infection+of+macrophages+mediated+by+the+SAMHD1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vpx relieves inhibition of HIV-1 infection of macrophages mediated by the SAMHD1 protein.</a> Nature. 474 (7353), 658-661 (2011).</li>
<li>Seki, A., Rutz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+RNP+transfection+for+highly+efficient+CRI+SPR%2FCas9-mediated+gene+knockout+in+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Optimized RNP transfection for highly efficient CRI SPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells.</a> J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).</li>
<li>Batista Napotnik, T., Polajžer, T., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+due+to+electroporation+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell death due to electroporation - A review.</a> Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).</li>
<li>Perretta-Tejedor, N., Freke, G., Seda, M., Long, D. A., Jenkins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+mutant+renal+cell+lines+using+CRISPR+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generating mutant renal cell lines using CRISPR technologies.</a> Methods Mol Biol. 2067, 323-340 (2020).</li>
<li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+validation+strategies+for+CRISPR-Cas9+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing.</a> Sci Rep. 8 (1), 888(2018).</li>
<li>Makino, S., Fukumura, R., Gondo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illegitimate+translation+causes+unexpected+gene+expression+from+on-target+out-of-frame+alleles+created+by+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Illegitimate translation causes unexpected gene expression from on-target out-of-frame alleles created by CRISPR-Cas9.</a> Sci Rep. 6, 39608(2016).</li>
<li>Bowling, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+alternate+start+site+allows+N-terminal+nonsense+variants+to+escape+NMD+and+results+in+functional+recovery+by+readthrough+and+modulator+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">Downstream alternate start site allows N-terminal nonsense variants to escape NMD and results in functional recovery by readthrough and modulator combination.</a> J Pers Med. 12 (9), 1448(2022).</li>
<li>Inácios, Â, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+mutations+in+close+proximity+to+the+initiation+codon+fail+to+trigger+full+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense mutations in close proximity to the initiation codon fail to trigger full nonsense-mediated mRNA decay.</a> J Biol Chem. 279 (31), 32170-32180 (2004).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+inversions+and+duplications+of+mammalian+regulatory+DNA+elements+and+gene+clusters+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient inversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9.</a> J Mol Cell Biol. 7 (4), 284-298 (2015).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+inversion+of+CTCF+sites+alters+genome+topology+and+enhancer%2Fpromoter+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function.</a> Cell. 162 (4), 900-910 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,2 &micro; m filtro de seringa</td><td>ClearLine</td><td>146560</td><td>_</td></tr><tr><td>0.4 % azul tripano</td><td>Beckman Coulter</td><td>383200</td><td>_</td></tr><tr><td>Tubo de 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td>_</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Corning</td><td>353047</td><td>_</td></tr><tr><td>6x TriTrack DNA Loading Dye</td><td>Thermo scientific</td><td>R1161</td><td>_</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; Frasco de cultura Tampa ventilada</td><td>Corning</td><td>353136</td><td>_</td></tr><tr><td>8-Strip PCR Tubes com tampas</td><td>Life technologies</td><td>AM12230</td><td>_</td></tr><tr><td>Placas de 96 poços Fundo plano</td><td>Corning</td><td>353072</td><td>_</td></tr><tr><td>Placas de 96 poços Fundo redondo</td><td>Corning</td><td>353077</td><td>_</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Euromedex</td><td>D5</td><td>_</td></tr><tr><td>ATGpr</td><td>_</td><td>_</td><td>https://atgpr.dbcls.jp/</td></tr> <tr><td>ChemiDoc Imaging System</td><td>BIO-RAD</td><td>12003153</td><td>_</td></tr><tr><td>Lâmina de contagem</td><td>NanoEntek</td><td>DHC-N04</td><td>_</td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>_</td><td>_</td><td>http://crispor.gi.ucsc.edu/</td></tr> <tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>_</td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>EMBL-EBI</td><td>_</td><td>https://www.ensembl.org/index.html</td></tr><tr><td>Fetal Bovino Soro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>_</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Life Sciences</td><td>v10.10</td><td>_</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td><td>Thermo scientific</td><td>SM0323</td><td>_</td></tr><tr><td>Genome Data Viewer</td><td>NCBI</td><td>_</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/</td></tr> <tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td>_</td><td>Version 9.3.1</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polimerases</td><td>Agilent</td><td>600679</td><td>_</td></tr><tr><td>ICE Ferramenta de Análise CRISPR</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis</td></tr><tr><td>Image Lab Touch</td><td>BIO-RAD</td><td>_</td><td>Version 2.4.0.03</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Incluído com T7EI M0302S</td></tr><tr><td>Neon Kit, 10 &micro; L</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025K</td><td>Kit de eletroporação contendo pontas, tubos, tampão R e E</td></tr><tr><td>Sistema de transfecção de néon</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>_</td></tr><tr><td>NetStart 1.0</td><td>_</td><td>https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/</td><td></td></tr> <tr><td>Nuclease-free Water</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>_</td></tr><tr><td>PCR primer (EGFP)</td><td>Eurofins</td><td>_</td><td>Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT</td></tr><tr><td>Primer PCR (SAMHD1)</td><td>Eurofins</td><td>_</td><td>Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev: GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U / mL)</td> <td>Gibco</td><td>15140122</td><td>_</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15714</td><td>_</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>_</td></tr><tr><td>PrimerQuest</td><td>IDT</td><td>_</td><td>https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest</td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>_</td></tr><tr><td>Solução de extração de DNA QuickExtract</td><td>Biosearch Technologies</td><td>QE09050</td><td>_</td></tr><tr><td>RPMI 1640, GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870010</td><td>_</td></tr><tr><td>SnapGene Viewer</td><td>Dotmatics</td><td>_</td><td>Version 7</td></tr><tr><td>SpCas9 2NLS Nuclease</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>_</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>_</td></tr><tr><td>Synthetic sgRNA (EGFP)</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGGGGGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG</td></tr><tr><td>SgRNA sintético (SAMHD1)</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU</td></tr><tr><td>Seringa Plastipak Luer Lock</td><td>BD</td><td>301229</td><td>_</td></tr><tr><td>T100 Termociclador</td><td>BIO-RAD</td><td>1861096</td><td>_</td></tr><tr><td>T7 endonuclease I</td><td>Novo England Biolabs</td><td>M0302S</td><td>_</td></tr><tr><td>TAE tampão UltraPure, 10x</td><td>Invitrogen</td><td>15558026</td><td>400 mM Tris-Acetato, 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>THP-1 células</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td>_</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05 %)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>_</td></tr><tr><td>ZE5 Cell Analyzer</td><td>BIO-RAD</td><td>12014135</td><td>_</td></tr></tbody></table>

nocaute de gene mediado por crispr-cas9 baseado em eletroporação em células thp-1 e isolamento de clone de célula única

Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation

Uma linhagem celular THP-1 foi gerada expressando de forma estável a proteína repórter GFP (THP-1_GFP) (Figura 2A) e usada como ferramenta para estabelecer um protocolo para uma edição eficiente do gene mediada por CRISPR-Cas9. Para este objetivo, 3 sgRNA direcionados ao gene EGFP foram projetados com a ferramenta CRISPOR web29 (Figura 2B), que foram simultaneamente complexados com Cas9 em uma proporção molar de 9: 1 para formar ...

Nocaute de gene mediado por CRISPR-Cas9 baseado em eletroporação em células THP-1 e isolamento de clone de célula única

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including ...

electroporation-based-crispr-cas9-mediated-gene-knockout-thp-1-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neste vídeo, demonstramos a edição completa do genoma baseada em CRISPR-Cas9 em células cultivadas, onde Cas9 e sgRNA são fornecidos como uma única construção de plasmídeo para as células. O sistema CRISPR-Cas9 e o gene desejado a ser inserido foram introduzidos nas células por meio da técnica de eletroporação para facilitar a edição gênica bem-sucedida.

Edição do genoma CRISPR tudo-em-um: um método para knock-in de gene baseado em reparo dirigido por homologia em células cultivadas usando o sistema CRISPR-Cas9

Este vídeo demonstra um ensaio para realizar a edição de genes em células T humanas usando a tecnologia CRISPR-Cas9. Uma mistura de células T CD4+ e CD8+ primárias é combinada com um complexo ribonucleoproteico CRISPR-Cas9, visando genes específicos para nocaute. Após a eletroporação, o sgRNA guia Cas9 para a sequência de DNA alvo, criando cortes precisos. Esses cortes são então reparados pelo mecanismo de junção final não homólogo da célula, levando ao nocaute do gene.

Uma técnica CRISPR-Cas9 para edição de genes em células T

A técnica de genotipagem descrito aqui, que acopla reacção em cadeia da polimerase fluorescente (PCR) para electroforese em gel capilar, permite a genotipagem de alto rendimento de clones knockout mediada por nucleases. É contorna as limitações enfrentadas por outras técnicas de genotipagem e é mais rentável do que os métodos de sequenciação.

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

Os avanços recentes na capacidade de manipular geneticamente as linhas celulares somáticas possuem grande potencial para pesquisas básicas e aplicadas. Aqui, apresentamos duas abordagens para CRISPR / Cas9 gerado produção knockout e triagem em linhas de células de mamíferos, com e sem o uso de marcadores selecionáveis.

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

Este protocolo descreve detalhadamente a geração de células-tronco livre pegada pluripotentes induzidas (iPSCs) de células do pâncreas humanas em condições de livre de alimentador, seguido pela edição usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e caracterização de modificado clones de célula única.

Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

Um protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediada disrupção do gene no mouse e células hematopoiéticas primárias humanas é descrito neste artigo. Ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA são introduzidas através de eletroporação com sgRNAs gerados através da transcrição em vitro e Cas9 comercial. Alta eficiência de edição é obtida com tempo limitado e custo financeiro.

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Aqui, apresentamos um protocolo para modificar geneticamente as células assassinas naturais humano primário ou expandido (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Usando este protocolo, geramos humanas células NK deficientes para transformar o receptor 2 do fator de crescimento – b (TGFBR2) e hipoxantina Fosforibosiltransferase 1 (HPRT1).

Geração de células NK humana primárias e expandida de Knock-out usando ribonucleoproteínas Cas9

É apresentado aqui um protocolo para a edição eficiente do gene de CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-negociado em pilhas de mamíferos usando o electroporation do tubo.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteína-mediada por Gene preciso de edição por tubo Electroporation

O método apresentado descreve a geração de um nocaute gênico mediado por CRISPR na linhagem H9 de células-tronco embrionárias humanas (hESC), que expressa de forma estável sgRNAs direcionados ao gene L2HGDH usando um sistema de entrega de genes mediado por lentivírus altamente eficiente.

Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

Aqui, descrevemos um protocolo abrangente para gerar e utilizar organoides de glioblastoma projetados em laboratório (LEGO) para investigar dependências genótipo-fenótipo e rastrear possíveis medicamentos para tratamento de glioblastoma.

Cultura de organoide de glioblastoma projetada em laboratório e triagem de drogas

Um protocolo detalhado é fornecido para o uso da tecnologia CRISPR / Cas9 para obter knock-in direcionado altamente eficiente de grandes construções multicistrônicas em células T humanas primárias por meio da via de reparo de DNA de junção de extremidade mediada por homologia (HMEJ). As células T projetadas com este protocolo adaptável ao cGMP mantêm excelente expansão celular, citotoxicidade e produção de citocinas.

Engenharia não viral de células T humanas primárias por meio de integração direcionada de junção de extremidade mediada por homologia de grandes modelos de DNA

Aprenda a editar genes em células THP-1 usando CRISPR-Cas9 e eletroporação para estudar resistência ao HIV. Este protocolo permite isolar clones de célula única e investigar o papel da enzima HT-1 na replicação viral.

Nocaute de gene mediado por CRISPR-Cas9 baseado em eletroporação em células THP-1 e isolamento de clone de célula única

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