Name: Otimização rápida de um sistema induzível por luz para controlar a expressão gênica de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-04T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprenda a otimizar a expressão gênica induzível por luz em células HEK293T usando a ferramenta optogenética LACE e matrizes de LED impressas em 3D. Este método de alta vazão melhora o controle da expressão em mamíferos.

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<table><tbody><tr><td>Tubos microcentrífugas de 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>10025-724</td><td></td></tr><tr><td>Reservatórios de Reagentes de 10 mL</td><td>VWR</td><td>77395-252</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas de 10 mL</td><td>VWR</td><td>75816-100</td><td></td></tr><tr><td>1000 & mu; Ponteiras do filtro L</td><td>VWR</td><td>76322-154</td><td></td></tr><tr><td>15 mL&nbsp; Tubos de centrífuga de alto desempenho, tampa plana</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de Potência Óptica 1931-C</td><td>Newport</td><td>1931-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas de 2 mL</td><td>VWR</td><td>75816-104</td><td></td></tr><tr><td>20 & mu; Ponteiras do filtro L</td><td>VWR</td><td>76322-134</td><td></td></tr><tr><td>200 & mu; Ponteiras do filtro L</td><td>VWR</td><td>76322-150</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de alto desempenho de 50 mL, tampa plana</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fundo em V de 96 poços</td><td>BRANDplates</td><td>781661</td><td></td></tr><tr><td>A21, lâmpada LED vermelha</td><td>Lâmpadas Bluex</td><td>N/A</td><td>Fonte de luz vermelha</td></tr><tr><td>Arduino IDE Software</td><td>Arduino</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Armário de Biossegurança, Classe II</td><td>NuAire</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitometro de Linha Brilhante</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Slides de contagem de células</td><td>BioRad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura Celular 96-poços, placa inferior de vidro #1,5H</td><td>Cellvis</td><td>P96-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert Software</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Pronto para Uso Diário de Fluorosferas de Qualidade</td><td>Beckman Coulter</td><td>C65719</td><td>4 & deg; C</td></tr><tr><td>Citômetro de Fluxo CytoFLEX-S (4 canais violetas, 2 azuis, 4 amarelas verdes, 3 vermelhas)</td><td>Beckman Coulter</td><td>C09766</td><td></td></tr><tr><td>Pó de soro salino tamponado com fosfato da Dulbecco, sem cálico, sem magnésio</td><td>Fisher Scientific</td><td>21600069</td><td>Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5804</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; 022622501</td><td>Etapa da centrífuga com placa inferior em V</td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus, 8 canais, volume variável, 30 - 300 e mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus, canal único, volume variável, 100 - 1000 & mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus, canal único, volume variável, 2 - 20 e mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus, canal único, volume variável, 20 - 200 e mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Fita de Rotulagem de Laboratório de Uso Geral</td><td>VWR</td><td>89097-920</td><td></td></tr><tr><td>DMEM gibco, pó, glicose alta</td><td>Fisher Scientific</td><td>12100061</td><td>4 & deg; C</td></tr><tr><td>Gibco Trypan Blue Solução, 0,4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td>Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Gibco Value Heat Inactivated FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A5256901</td><td>-20 & deg; C</td></tr><tr><td>Gibco, Tripsina-EDTA (0,05%), com EDTA, Origem Animal, 1X, Fenol Vermelho, 500 mL</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td>-20 & deg; C</td></tr><tr><td>HEK293T Células</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>-80 &deg; C, Nitrogênio Líquido</td></tr><tr><td>Marcadores de laboratório, Micronova</td><td>VWR</td><td>89205-944</td><td></td></tr><tr><td>Abajur de Mesa de Metal</td><td>Designs Simples</td><td>N/A</td><td>Lâmpada para luz vermelha</td></tr><tr><td>OptoPlate-96</td><td>LABmaker</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XP de auxílio de pipeta</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo: CIBN-gRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>-20 & deg; C</td></tr><tr><td>Plasmídeo: CMV-eGFP</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>-20 & deg; C</td></tr><tr><td>Plasmídeo: CRY2-eGFP</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>-20 & deg; C</td></tr><tr><td>Reagente de Transfecção In Vitro de DNA PolyJet</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1536117</td><td>4 & deg; C</td></tr><tr><td>Frasco de Cultura Celular T-75</td><td>VWR</td><td>10062-860</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO com Camisa de Água</td><td>VWR</td><td>10810-884</td><td></td></tr></tbody></table>

otimização rápida de um sistema induzível por luz para controlar a expressão gênica de mamíferos

Rapid Optimization of a Light-Inducible System to Control Mammalian Gene Expression

Otimização rápida de um sistema induzível por luz para controlar a expressão gênica de mamíferos

Inducible gene expression tools can open novel applications in human health and biotechnology, but current options are often expensive, difficult to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Este vídeo demonstra o sistema de expressão gênica da tetraciclina, ou Tet-On, em um modelo de camundongo. Na presença de doxiciclina, um derivado da tetraciclina, o sistema Tet-On que consiste na proteína transativadora reversa controlada por tetraciclina é ativado e expressa o gene de interesse.

Expressão gênica baseada em sistema regulável por tet-on induzível in vivo: um sistema de expressão gênica induzido por tetraciclina para ativação da transcrição do gene alvo em modelo de camundongo

Este protocolo descreve o procedimento experimental para a rápida construção de factores de transcrição artificiais (ATFs) com repórteres GFP cognatas e quantificação da capacidade ATFs para estimular a expressão de GFP por meio de citometria de fluxo.

Síntese rápida e Triagem de fatores de transcrição ativada quimicamente com jornalistas baseados em GFP

O método descrito aqui é usado para induzir a cascata de sinalização apoptótica em etapas definidas, a fim de dissecar a atividade de uma proteína efetora bacteriana antiapoptótica. Este método também pode ser usado para expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicas, ou para dissecar interferência com outras vias de sinalização.

Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

Este protocolo descreve uma estratégia optogenética para modular a atividade da proteína quinase ativada por mitógenos (MAPK) durante a diferenciação celular e o desenvolvimento embrionário de Xenopus . Este método permite a ativação reversível da via de sinalização MAPK na cultura de células de mamíferos e em organismos vivos multicelulares, como embriões Xenopus , com alta resolução espacial e temporal.

Modulação Reversível Mediada por Luz do Caminho Protein Quinaso Ativado por Mitogênio durante a Diferenciação Celular e<em&gt; Xenopus</em&gt; Desenvolvimento embrionário

Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a transferência de célula a célula de informação oscilatória pelo controle de optogenetic e viver monitoramento da expressão do gene. Essa abordagem fornece uma plataforma única para testar um significado funcional dos programas de expressão do gene dinâmico em sistemas multicelulares.

Um método de Optogenetic para controlar e analisar os padrões de expressão de Gene em interações de célula para célula

Este protocolo descreve as etapas necessárias para gerar um modelo de sistema em que a transcrição de um gene endógeno de interesse pode ser condicionalmente controlada em animais vivos ou células usando reforçada ALC repressor e/ou sistemas de ativador de tet .

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

O controle confiável das células mamíferas responsivas à luz requer a padronização dos métodos optogenéticos. Em direção a esse objetivo, este estudo descreve um pipeline de construção de circuitos genéticos, engenharia celular, operação de equipamentos optogenéticos e ensaios de verificação para padronizar o estudo da expressão genética induzida pela luz usando um circuito genético optogenético de feedback negativo como estudo de caso.

Engenharia confiável e controle de circuitos genéticos estáveis em células mamíferas

Optogenética é uma ferramenta poderosa com aplicações abrangentes. Este protocolo demonstra como alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish usando o sistema TAEL/C120 de resposta à luz azul.

Expressão GFP induzida pela luz em embriões de zebrafish usando o sistema OPtogenético TAEL/C120

A luz de bioluminescência emitida por uma enzima luciferase oxidando um substrato de molécula pequena, uma luciferina pode ser aproveitada para ativar proteínas fotosensoriais, adicionando assim outra dimensão à estimulação da luz e permitindo a manipulação de uma infinidade de funções mediadas pela luz em células através de escalas temporais e espaciais.

Bioluminescente Optogenética 2.0: Aproveitamento da Bioluminescência para Ativar Proteínas Fotosensory In Vitro e In Vivo

O controle optogenético do metabolismo microbiano oferece controle dinâmico flexível sobre os processos de fermentação. O protocolo aqui mostra como configurar fermentações reguladas por luz azul para produção química e proteica em diferentes escalas volumosas.

Fermentações controladas por luz para produção de produtos químicos e proteicos microbianos

Este protocolo descreve a aplicação de um domínio de interruptor alostérico ativado por luz azul (LightR) projetado para controle espaço-temporal reversível da atividade da proteína. Utilizando Src tirosina quinase como modelo, este estudo oferece um protocolo elaborado para desenvolver e caracterizar Src regulado por luz (LightR-Src). Isso demonstra a versatilidade dessa abordagem em todas as classes de enzimas.

Controle espaço-temporal da atividade proteica por meio da regulação alostérica optogenética

Aprenda a otimizar a expressão gênica induzível por luz em células HEK293T usando a ferramenta optogenética LACE e matrizes de LED impressas em 3D. Este método de alta vazão melhora o controle da expressão em mamíferos.

Otimização rápida de um sistema induzível por luz para controlar a expressão gênica de mamíferos

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