Name: Microscopia de Localização de Molécula Única de Proteínas de Membrana usando Marcagem de Único Anticorpo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprenda a técnica de marcação com anticorpo único para visualizar interações anticorpo-epitopo em membranas de células T usando microscopia de localização de molécula única. Este método permite mapear a distribuição espacial de proteínas de membrana em seu ambiente celular nativo.

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<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-CD81 Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-44132</td><td>Anticorpo de imagem</td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sérica bovina</td><td>MilliporeSigma</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Vidro com tampa com câmara, 8 poços</td><td>Cellvis</td><td>C8-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Mídia DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>Soro Tamponado de Fosfato da Dulbecco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>MilliporeSigma</td><td>F0926-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído, 10 %</td><td>Ciências da Microscopia Eletrônica</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Coloides de ouro, 100 nm</td><td>Ted Pella</td><td>15711 e menos; 20</td><td>Marcador fiducial</td></tr><tr><td>Óleo de imersão &nbsp;</td><td>Laboratórios Cargille</td><td>16245</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido&nbsp; equipado com módulo TIRF</td><td>Instrumentos Nikon</td><td>Eclipse Ti2-E</td><td>Microscópio</td></tr><tr><td>Linha celular Jurkat E6.1</td><td>MilliporeSigma</td><td>88042803-1VL</td><td>Células de suspensão</td></tr><tr><td>Lançamento a laser, 6 linhas</td><td>Oxxius</td><td>L6CC-CS8-1511</td><td>Laser de excitação</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga, 1,5 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagem por microscopia</td><td>Instrumentos Nikon</td><td>Pesquisa Avançada NIS-Elementos</td><td>Software de avaliação de imagens</td></tr><tr><td>Objectivo, 100x/1.49 CFI APO TIRF & nbsp;</td><td>Instrumentos Nikon</td><td>MRD01991</td><td>Objetivo do microscópio</td></tr><tr><td>Paraformaldeído, 16 %</td><td>Ciências da Microscopia Eletrônica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Solução de poli-L-lisina, 0,01%&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>P4707-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Câmera Prime 95B sCMOS</td><td>Soluções Teledyne Vision</td><td>01-PRIME-95B-R-M-16-C</td><td>Câmera</td></tr><tr><td>Mídia RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>Mídia para células de suspensão</td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19038-1000</td><td></td></tr><tr><td>Borohidreto de sódio</td><td>MilliporeSigma</td><td>213462-25G</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultura T25</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>169900</td><td></td></tr><tr><td>Microsferas TetraSpeck</td><td></td><td></td><td>Marcador fiducial</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos, 100 mm & nbsp;</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Células aderentes</td></tr></tbody></table>

microscopia de localização de molécula Única de proteínas de membrana usando marcagem de Único anticorpo

Single-Molecule Localization Microscopy of Membrane Proteins using Single-Antibody Labeling

Microscopia de Localização de Molécula Única de Proteínas de Membrana usando Marcagem de Único Anticorpo

The plasma membrane defines the cell shape and serves as the interface that governs intercellular communication. Membrane proteins constitute a major ...

single-molecule-localization-microscopy-membrane-proteins-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Demonstramos o uso da microscopia de localização por fotoativação por fluorescência (FPALM) para obter imagens simultâneas de vários tipos de moléculas marcadas com fluorescência dentro das células. As técnicas descritas produzem a localização de milhares a centenas de milhares de proteínas individuais marcadas com fluorescência, com uma precisão de dezenas de nanômetros dentro de células individuais.

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

A preparação de bicamadas lipídicas planares com suporte de vidro funcionalizadas por proteínas, determinação da mobilidade de proteínas e medição de densidades de proteínas é mostrada aqui. Um roteiro para a construção de um microscópio de reflexão interna total com redução de ruído é delineado, o que permite visualizar fluorocromos residentes em uma única camada com alta resolução espaço-temporal.

Bicamadas única molécula de microscopia de fluorescência em Planar Apoiado

Demonstamos um método para imagem de múltiplas moléculas dentro de nanoestruturas heterogêneas com precisão de molécula única usando ligação sequencial e eluição de anticorpos marcados fluorescentemente.

Imagem altamente multiplexada e de super resolução de células T usando madSTORM

Aqui, apresentamos um protocolo para multi cor localização das proteínas de membrana única em organelas de células vivas. Para anexar fluorophores, auto rotulação de proteínas são utilizadas. Proteínas, localizadas em compartimentos diferentes membranas da organela a mesma, podem ser localizadas com precisão de ~ 18 nm.

Localização de cor multi microscopia de proteínas de membrana única em organelas de células de mamíferos vivas

Apresentamos um protocolo para a detecção óptica em tempo real de proteínas sem rótulo única, como eles são secretados de células vivas. Isto é baseado em microscopia de dispersão interferométricas (iSCAT), que pode ser aplicada a uma variedade de diferentes sistemas biológicos e configurações.

Etiqueta-Free Imaging de único proteínas secretadas de células vivas através de iSCAT microscopia

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a homogeneidade de rotulagem para cada espécie de proteína em uma amostra de proteína complexa a nível da molécula.

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

a microscopia da localização da único-molécula 3D é utilizada para sondar as posições espaciais e as trajetórias do movimento de proteínas cDNAs etiquetadas em pilhas bacterianas vivas. O protocolo de análise experimental e de dados descrito neste documento determina os comportamentos diffusivos prevalentes de proteínas citosómicas baseadas em trajetórias unimoléculas agrupadas.

Microscopia de seguimento da único-molécula-uma ferramenta para determinar os Estados diffusive de moléculas cytosolic

Este protocolo descreve uma abordagem de processamento de imagem baseada em iSCAT e rastreamento de partículas únicas que permite a investigação simultânea da massa molecular e o comportamento difuso de macromoléculas interagindo com membranas lipídicas. Instruções passo a passo para preparação da amostra, conversão em massa para contraste, aquisição de filmes e pós-processamento são fornecidas juntamente com direções para evitar possíveis armadilhas.

Rastreamento de partículas sensíveis à massa para caracterizar dinâmicas de macromolécula associadas à membrana

Aqui, um protocolo para realizar e analisar a ligação, mobilidade e montagem de moléculas individuais em membranas lipídicas artificiais apinhadas usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total de molécula única (smTIRF) é apresentado.

Difusão e Montagem de Molécula Única em Membranas Lipídicas Repletas de Polímeros

Este artigo fornece uma descrição detalhada de como criar amostras para rastreamento de proteína única em bicamadas lipídicas suportadas por sólidos. Também explica um microscópio de fluorescência simples, com sensibilidade a molécula única e taxa de quadros rápida. Por fim, descrevemos o procedimento para extrair trajetórias de proteína única.

Rastreamento de proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência

Aprenda a técnica de marcação com anticorpo único para visualizar interações anticorpo-epitopo em membranas de células T usando microscopia de localização de molécula única. Este método permite mapear a distribuição espacial de proteínas de membrana em seu ambiente celular nativo.

Microscopia de Localização de Molécula Única de Proteínas de Membrana usando Marcagem de Único Anticorpo

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