Генерация дендритных клеток из костного мозга: метод получения дендритных клеток из костного мозга мыши

- Дендритные клетки или ДК являются ключевыми антигенпрезентирующими клетками, которые активируют Т-клетки. У пациентов с лейкемией эти клетки плохо экспрессируют опухолеассоциированный антиген и не могут вызвать антиген-специфический иммунный ответ. Дендритные клетки в изобилии присутствуют в костном мозге. И, следовательно, костный мозг является предпочтительным местом для их выделения, чтобы помочь изучить их роль в развитии рака.

Чтобы получить дендритные клетки, извлеките костный мозг из бедренной или большеберцовой кости усыпленной мыши с помощью шприца, наполненного средой, чтобы вымыть его. Центрифугируйте и ресуспендируйте гранулу в аммоний-хлоридно-калийный буфер или буфер ACK для лизиса эритроцитов. Теперь добавьте питательную среду для остановки лизиса и центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в питательной среде, содержащей антибиотик. Добавьте гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор или GM-CSF и перенесите клеточную суспензию на пластину Петри.

Инкубируйте пластину в течение желаемого времени. GM-CSF помогает клеткам-предшественникам дифференцироваться в дендритные клетки. Наконец, активируйте клетки липополисахаридами или ЛПС, которые связываются с поверхностным рецептором дендритных клеток, в результате чего образуются полностью зрелые и иммуногенные дендритные клетки костного мозга. В этом протоколе мы продемонстрируем генерацию дендритных клеток из костного мозга мыши.

- Для получения дендритных клеток, полученных из костного мозга, выделите костный мозг из бедренных костей дикого типа или мышей с нокаутом фактора В, как показано, и лизируйте эритроциты в 5 миллилитрах буфера для лизиса ACK, остановив реакцию 10 миллилитрами RPMI, дополненными 1% FBS через пять минут.

После сбора цельных клеток крови методом центрифугирования повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитров питательной среды в концентрации от 2 до 10 до 6 клеток на миллилитр и добавьте 20 нанограммов на миллилитр GM-CSF в клетки, прежде чем засеять 10 миллилитров клеток на отдельные чашки Петри размером 100 на 15 миллиметров при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение шести дней. На шестой день активируйте культуры дендритных клеток, полученные из костного мозга, с помощью 25 микрограммов на миллилитр ЛПС на пластину.