Стереотаксическое введение вирусов для стабильной генетической модификации в мышиной модели

Начните с мыши, находящейся под наркозом, с обнаженным черепом в стереотаксической рамке.

Опустите держатель шприца до тех пор, пока кончик иглы не совпадет с брегмой, точкой отсчета черепа.

Используя заранее определенные стереотаксические координаты, найдите желудочково-субвентрикулярную зону или

V-SVZ, нейрогенную нишу, в основном содержащую нейральные стволовые клетки или НСК, и отметьте эту область.

Извлеките шприц и осторожно просверлите небольшое отверстие, не допуская повреждения мозга.

Наполните стерильный шприц вирусами, несущими трансген, и расположите иглу над поверхностью мозга.

Переместите шприц и опустите его до тех пор, пока кончик не коснется самого внутреннего слоя поверхности мозга.

Проникните в мозг, чтобы добраться до V-SVZ, медленно введите вирус, задержите недолго, а затем извлеките шприц

.

В V-SVZ вирус проникает в НСК через мембранное слияние. Его РНК обратно транскрибируется в ДНК.

Затем эта ДНК интегрируется в геном НСК, обеспечивая стабильную генетическую модификацию НСК.

После обезболивания у шести-восьминедельных мышей бреют область между ушами. Далее продезинфицируйте кожу с помощью йодофора, такого как йод, повидон или 70% этанол. Затем поместите животное в положение лежа на стереотаксическую раму.

Аккуратно зафиксируйте его голову с помощью ушных планок и небной поддержки аппарата. Держите мышь на грелке, установленной при температуре 37 градусов Цельсия, и нанесите на ее глаза офтальмологическую смазку.

Далее сделайте разрез длиной 1 сантиметр на волосистой части головы и аккуратно втяните кожу, чтобы обнажить череп. Осторожно очистите поверхность кости стерильным аппликатором с ватным наконечником и удалите остатки ткани. После этого установите стерилизованный шприц на стереотаксическое устройство с помощью держателя шприца. Расположите иглу на брегме и убедитесь, что положение 0 дорсальной вентральной оси находится на поверхности черепа в брегме.

Теперь переместите шприц в обозначенные координаты x и y, затем аннотируйте координаты назначения x, y и z на шкале Вернье в качестве места инъекции и отметьте кость хирургическим маркером.

Шкала Нонье является точным измерительным инструментом, позволяющим с высокой точностью определять стереотаксические координаты по брегме. 0 на основной шкале обозначает единицы измерения, а число, выровненное по основной шкале, определяет десятые доли миллиметра.

После этого отодвиньте шприц от рабочей зоны. Осторожно просверлите отверстие на черепе, не повредив мозг.

Сверло должно быть установлено горизонтально по отношению к поверхности черепа, и необходимо осуществлять непрерывный мониторинг продвижения, чтобы остановить сверление после того, как поверхность пиала обнажена. Не повреждайте основной мозг.

Затем загрузите в шприц острую иглу 33-го калибра со скошенным углом 1 микролитр вирусного раствора. Расположите иглу шприца под углом 90 градусов к поверхности мозга. Переместите шприц обратно к месту инъекции и опускайте его до тех пор, пока кончик не коснется поверхности пиала и не проникнет в мозг.

Чтобы свести к минимуму повреждение тканей мозга из-за чрезмерного давления жидкости, медленно высвобождайте вирусную суспензию. После инъекции подождите от 5 до 10 минут, чтобы свести к минимуму обратный поток вирусной суспензии, прежде чем медленно втягивать шприц

.