Оценка взаимодействия бактерий и клеток-хозяев с помощью биомиметических шариков

Возьмите многолуночный планшет, содержащий культуру эпителиальных клеток млекопитающих.

В тестовые лунки добавьте бактериальный патоген вместе с полимерными шариками, связанными с бактериальными поверхностными белками.

В контрольные лунки добавьте возбудителя и шарики, в которых отсутствуют бактериальные поверхностные белки. Инкубировать.

В испытательных лунках шарики имитируют бактериальную поверхность и конкурируют с возбудителем за связывание с мембраной эпителиальной клетки фосфатидной кислотой, уменьшая бактериальное прикрепление.

В контрольных лунках бусины не влияют на прикрепление бактерий.

Удалите носитель и промойте буфером, чтобы удалить несвязанные компоненты.

Инкубируйте с неионогенным детергентом, чтобы лизировать клетки, высвобождая прикрепленные к мембране бактерии и шарики.

Пипеткой измельчите лизат для получения однородной суспензии и последовательно разбавляйте гомогенат с помощью буфера.

Перенесите разведения на агаровые планшеты, инкубируйте, чтобы дать возможность образоваться колониям, и подсчитайте колонии.

Тестовая пластина демонстрирует меньшее количество колоний, чем контрольная группа, что указывает на снижение взаимодействия бактерий и хозяина.

Приготовьте инфекционные среды, разбавив бактериальные культуры в бесцветные DMEM без добавок.

Предварительно подогретый до 37 градусов Цельсия, содержащий 10% объема суспензии гранул. Чтобы получить MOI 10, приготовьте один миллилитр на лунку и от 10 до 20% избыточного объема на образец. Удалите старую среду из лунок и промойте культивируемые клетки HeLa, добавив в каждую лунку по одному миллилитру стерильного PBS, предварительно подогретого до 37 градусов Цельсия. Удалите PBS и добавьте один миллилитр инфекционной среды на лунку. Добавьте растворы, содержащие контрольные гранулы и бактерии в качестве положительного контроля и адгезионные гранулы, и не содержащие бактерии в качестве отрицательного контроля.

Добавьте DMEM, содержащий 0,1% Triton X 100, в качестве контроля лизиса.

Инкубируйте планшет в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия в течение желаемого количества времени.

Измерения адгезии бактерий проводятся через час после заражения. Удалите среду из клеточного слоя и тщательно промойте клеточный слой стерильным предварительно подогретым PBS, чтобы удалить все неприкрепленные клетки. Мойтесь не менее трех-четырех раз с одним миллилитром PBS каждый раз. Лизируйте клетки-хозяева, добавив в каждую лунку по одному миллилитру стерильного раствора Triton X 100 в PBS объемного значения. Выдерживайте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Пипеткой вверх и вниз каждый образец несколько раз перед тем, как перенести содержимое каждой лунки в отдельные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Приготовьте десятикратное серийное разведение образцов в стерильный PBS. Нанесите 100 микролитров каждого образца на морской LB агар и распределите с помощью разбрасывателя ячеек. Оптимизируйте разведение в планшетах в зависимости от штаммов бактерий и временного момента.

Для этой экспериментальной установки разведение в 10 раз в пятый или в 10 раз в шестой раз даст подходящее количество КОЕ. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. На следующий день перечислите бактерии путем подсчета колоний.