Выделение и культивирование бактерий Clostridioides difficile из кишечника личинок данио-рерио

Начните с усыпленной личинки данио-рерио с кишечником, зараженным патогенной анаэробной бактерией Clostridioides difficile.

Закрепите верхнюю спинную часть туловища личинки и удалите ее голову, чтобы обнажить внутренние органы.

Закрепите среднюю часть спинного туловища и аккуратно изолируйте кишечник от полости тела.

Переложите изолированную кишку в микроцентрифужную пробирку, содержащую буфер.

Гомогенизируйте кишечник с помощью пестика, чтобы разрушить ткани и высвободить кишечные микробы.

Перенесите гомогенат в пробирку, содержащую селективную среду для выращивания с добавлением антибиотиков.

Инкубируйте гомогенат в анаэробной камере.

Анаэробные условия подавляют рост аэробных бактерий, в то время как антибиотики целенаправленно нацелены на рост нативных анаэробных кишечных микробов и подавляют их.

Clostridioides difficile устойчив к этим антибиотикам и размножается в анаэробных условиях.

Питательные вещества и факторы роста в питательной среде способствуют дальнейшему делению клеток, что способствует росту жизнеспособных Clostridioides difficile.

После усыпления зараженных личинок данио-рерио вставьте иглу в спинной ствол личинок данио-рерио близко к голове, чтобы обездвижить данио-рерио. Удалите голову за жабрами с помощью ланцета.

Вставьте вторую иглу в середину спинного туловища. Введите третью иглу в брюшную полость данио-рерио, и вытяните кишечник из полости тела. С помощью иглы для микроинъекций переведите от 10 до 15 кишечников в 1,5-миллилитровую пробирку, содержащую 200 микролитров стерильного 1X PBS.

Гомогенизируйте кишечник с помощью пестика, чтобы разрушить ткани и приготовить гомогенаты. Убедитесь, что пестик достигает дна трубки, чтобы полностью нарушить работу всех кишечников. В гомогенаты добавьте среду для выращивания Clostridioides difficile, содержащую D-циклосерин и цефокситин, с таурохолатом или без него, и инкубируйте в анаэробной камере.