Получение протопластов из грамположительной бактерии Bacillus megaterium

Возьмем культуру Bacillus megaterium, грамположительной бактерии.

Разведите культуру в свежей среде и инкубируйте ее с встряхиванием, чтобы способствовать делению бактерий.

Переложите культуру в пробирку и центрифугуйте для гранулирования бактерий.

Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в среде, содержащей осмотические стабилизаторы, чтобы предотвратить лизис протопластов.

Переложите ресуспендированный раствор в колбу, добавьте лизоцим, и выдержите при встряхивании.

Во время инкубации лизоцим разрушает толстую клеточную стенку пептидогликана бактерий.

По мере деградации клеточной стенки бактерии изменяются от палочковидной формы к сферическим телам, ограниченным только плазматической мембраной, образуя протопласты.

Визуализируйте суспензию под микроскопом.

Круглые бактерии подтверждают образование протопластов, в то время как набухшие палочковидные бактерии указывают на неполное пищеварение.

Переложите раствор в пробирку и центрифугу для гранулирования протопластов.

Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте протопласты в свежих средах, содержащих осмотические стабилизаторы, для дальнейшего анализа.

Чтобы получить грамположительные протопласты B. megaterium , разведите ночную бактериальную культуру в соотношении один к 1000 в 100 миллилитрах трехпроцентного TSB в колбе объемом 250 миллилитров для 4,5-часовой инкубации при 37 градусах Цельсия с встряхиванием. Когда оптическая плотность жидкой культуры достигает от 0,9 до 1,0 на 600 нанометрах, разделите бактерии между двумя 50-миллилитровыми коническими пробирками для их центрифугирования и используйте сирологическую пипетку для аспирации надосадочной жидкости. Повторно суспендируйте гранулы в 2,5 миллилитрах протопластовой среды на пробирку, и стяните суспензию в одну коническую пробирку для культивирования в колбе объемом 125 миллилитров.

Добавьте в культуру один миллилитр пяти миллиграммов на миллилитр лизоцима для одночасовой инкубации при 37 градусах Цельсия с встряхиванием. Наблюдение за ростом протопласта под световым микроскопом и замечание любых неровностей, таких как бактерии, которые проявляются в виде набухших палочек вместо сфер. По окончании инкубации переложите суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров для центрифугирования и повторно суспензируйте гранулу в пяти миллилитрах протопластовой среды.

Затем протопласты можно хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение недели или до тех пор, пока они не пройдут три цикла замораживания и оттаивания.