Энциклопедия экспериментов JoVE
Microbiology
0 просмотров • 2:28 мин. • September 26th, 2025
Начните с бактериологического исследования E. coli , выделенного у новорожденных с инфекциями кровотока.
Центрифугуйте для гранулирования бактерий, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в среде, не содержащей антибиотиков.
Возьмите пластину с трансвелловым вкладышем, содержащую монослой эпителиальных клеток кишечника.
Измерьте электрическое сопротивление по всему клеточному слою с помощью зонда, чтобы подтвердить целостность монослоя.
Добавьте бактериальную суспензию во вкладыш и инкубируйте.
Бактерии прикрепляются к эпителиальным клеткам, интернализуются в везикулах и транспортируются через клетки в нижнюю лунку с помощью процесса, называемого трансцитозом.
Еще раз измерьте электрическое сопротивление; Стабильное значение подтверждает наличие интактного монослоя при трансцитозе.
Переложите вкладыш в свежую лунку и соберите среду из предыдущей нижней лунки.
Выложите собранную среду на агаровую тарелку и инкубируйте для развития колоний бактерий.
Подсчитайте колонии, чтобы определить степень трансцитоза E. coli через кишечный эпителиальный барьер.
Каждые 30 минут после инокуляции заполняйте новые лунки 500 микролитрами ТКМ без антибиотиков и переносите вкладыши в эти новые лунки. Соберите среду из использованной сборной лунки для каждой вставки в отдельную промаркированную пробирку и поместите пробирку на лед. Возвращайте планшет Transwell в инкубатор между временными точками.
Для каждой вставки объедините собранные медиа из разных временных точек и кратко сформируйте вихрь. Нанесите собранную среду на шнековые пластины LB с использованием метода разведения дорожки, чтобы количественно определить количество трансцитозы бактерий в течение первых двух часов эксперимента. Собирайте носители через четыре и шесть часов.
Кроме того, через шесть часов обеспечьте загрузку среды из контрольных лунок. Через шесть часов измерьте и запишите TEER. После ночной инкубации подсчитайте колонии бактерий вручную на пластинах для разведения LB.