Энциклопедия экспериментов JoVE
Microbiology
0 просмотров • 3:13 мин. • September 26th, 2025
Возьмите культуру S. aureus , чувствительную к антибиотику хлорамфениколу.
Центрифуга для гранулирования бактерий и удаления надосадочной жидкости.
Переложите гранулу в пробирку с питательными веществами и инкубируйте. Питательный стресс повышает компетентность — способность бактерии усваивать чужеродную ДНК.
Снова центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в свежей среде, ограничивающей питательные вещества.
Затем добавьте ДНК, выделенную из штамма S. aureus , несущего ген, устойчивый к хлорамфениколу. Инкубировать.
Механизм поглощения ДНК перерабатывает ДНК в одну цепь и перемещает ее в цитоплазму, где она интегрируется в бактериальную хромосому.
Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в среде, богатой питательными веществами.
Перенесите суспензию в расплавленный богатый питательными веществами агар, содержащий хлорамфеникол.
Вылейте смесь в посуду и высушите.
Рост колоний, устойчивых к хлорамфениколу, указывает на успешное поглощение ДНК.
Культивируйте клетку-реципиента в течение ночи, в пяти миллилитрах TSB при 37 градусах Цельсия с встряхиванием. На следующее утро перелейте 0,5 миллилитров ночной культуры в 1,5-миллилитровую пробирку.
Осаждайте клетки путем центрифугирования. Затем суспензируйте клетки с 10 миллилитрами среды CS2 в 50-миллилитровую трубку. Затем выращивают бактерии при температуре 37 градусов по Цельсию с встряхиванием со скоростью 180 оборотов в минуту в течение восьми часов до поздней экспоненциальной фазы.
Соберите клетки с помощью центрифугирования. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 10 миллилитрах свежей среды CS2. Добавьте в клеточную суспензию 10 микрограммов очищенной плазмиды или геномной ДНК.
Встряхивайте культуру со скоростью 180 оборотов в минуту. Затем соберите клетки путем центрифугирования. Ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах среды BHI.
Смешайте клеточную суспензию с 90 миллилитрами расплавленного агара BHI с добавлением 32 миллиграммов на литр хлорамфеникола и пятью микрограммами на литр тетрациклина в контрольном эксперименте. Вылейте смесь в 90-миллиметровые чашки Петри и быстро остудите и дайте агару застыть. Реплицируйте колонии с помощью зубочисток на планшеты, содержащие соответствующие антибиотики, чтобы подтвердить их характеристики устойчивости.